鹿瓜多肽穴位注射治疗兔椎体骨折

胡熙耀，张玉芳，万 超，陈德森

鹿瓜多肽从干燥成熟甜瓜种子和梅花鹿骨骼中提取，是一类富含成纤维细胞生长因子和骨形态发生蛋白的多肽类灭菌水溶液。其骨形态发生蛋白可调节骨钙磷代谢，增加骨钙沉积，并通过刺激成骨细胞增殖来促进新骨和骨痂形成，使骨折得以修复和愈合[1-2]。其中的成纤维细胞生长因子还具有降低骨折局部毛细血管的通透性，促进骨折椎体血管内皮生长因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）的表达，减少骨折局部炎症细胞浸润，起到抗炎、镇痛、抗风湿等作用[3-4]。鹿瓜多肽可提骨质疏松性椎体压缩性骨折动物模型的骨形态发生蛋白和二聚糖的含量，对促进骨折的愈合起到决定作用[5]。VEGF可促进骨折局部血管新生，增加骨折局部血供、促进创伤的愈合[6]。临床上鹿瓜多肽主要用于骨折、骨质疏松等疾病的辅助治疗，由于其治疗骨折、骨质疏松的实验报导较少，对于治疗机制鲜有分析，本研究设计了新西兰兔L1–L5节段椎体压缩性骨折动物模型，采用穴位注射骨折部位肌肉的方法，观察注射用鹿瓜多肽对该模型动物VEGF及椎间盘二聚糖的影响。

1 材料与方法

1.1 动物及分组 SPF级健康新西兰兔48只，兔龄6～7个月，体质量1.8～2.2 kg。采用随机数字表编号随机分随机分为空白对照组、模型组、鹿瓜多肽小剂量组、鹿瓜多肽大剂量组，每组8只。动物房湿度50%～75%，温度18～25 ℃。

1.2 试剂及药品 注射用鹿瓜多肽（黑龙江迪龙制药有限公司，批号20160721）；兔抗鼠VEGF抗体（上海心语生物科技有限公司，批号160703）。

1.3 兔L1–L5节段椎体骨折动物模型制备 10%水合氯醛（0.35 g/kg）注射兔腹腔麻醉。腹部向下固定，纱布蘸取质量分数为8%的硫化钠涂于相当于椎体L1–L5水平皮肤，退掉术区兔毛。碘伏消毒，用体积分数75%乙醇脱碘，铺无菌巾。纵行切开兔L1–L5节段椎体皮肤，暴露兔腹膜后间隙，钝性分离兔L1–L5节段背阔肌、背最长肌、棘间肌、韧带，分离暴露L1–L5节段的椎间盘。钢丝剪小心从椎体侧前方剪断L1–L5节段椎体前缘，椎体不做内固定。分层缝合，再次消毒，乙醇脱碘。术后肌肉注射4万单位庆大霉素，1次/d，注射7 d。术后单笼饲养，每日强迫动物活动6 h，利用动物运动和重身重量压缩造成椎体骨折。空白对照组仅腹腔注射10%水合氯醛（0.35 g/kg）麻醉及手术区剃毛。

成模依据和标准[7]：兔具有发达的腹侧肌群及脊柱背侧肌群等生物学特性，在术后不做内固定也不会出现明显骨折断端移位现象。兔清醒站立时因脊柱负重，L1–L5节段骨折椎体处于挤压的状态，其被剪断的L1–L5节段椎体断端骨小梁会相互挤压、嵌插、扭曲，导致L1–L5节段椎体变短，在2周内就会因为自身重力和强迫运动等因素的作用下压缩变短。造模14 d时对动物进行拍摄CR分析造模效果，发现均出现明显的椎体压缩变短病理改变，说明建模成功，模型成功率为100%。

1.4 治疗方法 椎体压缩骨折术后14 d伤口愈合，尊循循经选穴的原则，选L1–L5脊柱两侧夹脊穴，配合血海、足三里、阳陵泉穴位注射鹿瓜多肽，治疗14 d。小剂量组穴位注射鹿瓜多肽3 mL•kg-1•d-1，鹿瓜多肽大剂量组 6 mL•kg-1•d-1，连续治疗21 d。空白对照组及模型组注射等量生理盐水作为对照。

1.5 检测指标及方法 于治疗前后分别处死6只动物，取兔L1–L5节段骨折椎体（骨痂组织），中性甲醛固定，销酸脱钙4～5 h，石蜡包埋。VEGF采用免疫组化染色法（SP法）检测，DAB显色，脱水透明封片，阳性结果判定以胞浆内棕色颗粒为阳性信号，以棕褐色反应产物代表抗原的定位，随机选取5个视野，以阳性细胞数占细胞总数百分率表示VEGF阳性表达率。另取骨痂组织标本于液氮冷冻，实时定量聚合酶链反应（RT-qPCR）检测VEGF mRNA表达。检测时将上述标本置无菌研钵研碎，脱钙后组织匀浆，移入离心管，3000 r/min离心。PCR扩增引物序列用P fi mer5软件设计，检测时先用RNA抽提试剂盒提取匀浆液中总RNA并逆转录合成cDNA；配制PCR的总反应体系，以β-actin为内参为内参，PCR扩增后RT-PCR分析VEGF mRNAR表达水平。VEGF上游引物：5’-ACAGGCATCGCCTACGCTAC-3’，下游引物：5’-GCATCCTCTAGCTGACGCACG-3’。内参上游引物：5’-ACTACCTGGATACCATCGACTAC-3’，下游引物：5’-CTAACCCTAGCGGATGGTC-3’。PCR反应条件：95℃预变性2 min，95℃、52℃、72℃各30 s，扩增40个循环。使用Curve Expert 1.3软件绘制上述样本标准曲线，以OD值为纵坐标、标准品的浓度为横坐标，以目的基因灰度值/β-actin灰度值表示VEGF mRNAR的表达值，读取VEGF mRNA相对表达量。采用免疫荧光法测定兔腰椎间盘组织二聚糖。

1.6 统计学处理 使用SPSS 17.0统计分析软件 ,本实验所有数据均计算标准差，以± s 表示，对于组间的均数检验和组间两两比较采用LSD-t检验，以P＜0.05，为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 VEGF、VEGF mRNA表达测定 空白对照组兔L1–L5节段椎体骨折椎体VEGF阳性细胞表达数量较少，治疗前后无明显变化。与空白对照组比较，模型组在L1–L5节段骨折椎体VEGF阳性表达率明显升高（P＜0.05）。经21 d治疗，与模型组比较,鹿瓜多肽鹿瓜多肽小/大剂量VEGF阳性表达率明显升高（P＜0.05），但鹿瓜多肽小/大剂量两组组间比较无差异（P＞0.05）。如表1和图1。经 RT-PCR检测VEGF mRNA表达，与空白对照组比较，模型组在L1–L5节段骨折椎体VEGF mRNA表达明显升高（P＜0.05），与VEGF阳性表达率一致。经21 d治疗，与模型组比较，鹿瓜多肽鹿瓜多肽小/大剂量VEGF mRNA表达明显升高（P＜0.05），但鹿瓜多肽小/大剂量两组组间比较无差异（P＞0.05）。见图2和图3。

2.2 二聚糖光密度及骨密度比较 空白对照组L1–L5节段椎间盘二聚糖光密度及骨密度治疗前后保持在较高水平，且治疗前后无明显变化（P＞0.05）；模型组二聚糖光密度及骨密度在治疗前后均明显降低，与空白对照组比较有差异（P＜0.05）。鹿瓜多肽小/大剂量治疗21 d后，二聚糖光密度及骨密度显著升高，与模型组比较有差异（P＜0.05）；鹿瓜多肽小/大剂量两组间比较无差异（P＞0.05）。见表 2。

表1 兔L1–L5节段骨折椎体VEGF蛋白阳性表达率及VEGF mRNA/β-actin灰度值比值比较（n=6， ）

图1 4组大鼠VEGF阳性表达率比较

图3 4组大鼠VEGF mRNA相对表达水平比较

图2 4组大鼠VEGF mRNA电泳图

2.3 治疗后X线比较 在治疗的21 d时，模型组兔L1节段椎体骨折椎体明显变短增粗，骨折处椎体骨密度较邻近椎体高，有带状致密阴影或低密度线，骨折椎体未愈合（见图1）。鹿瓜多肽小/大剂量组骨折处椎体骨密度接近或高于相邻椎体，有少量斑片状阴影，骨折椎体较相邻短、略粗，骨折椎体基本愈合（见图1-图3）。

表2 二聚糖光密度及骨密度比较（n=6， ）

图1 模型组

图2 鹿瓜多肽小剂量组

图3 鹿瓜多肽大剂量组

3 讨论

L1–L5节段椎体骨折较为常见，以50岁以上的绝经老年妇女为多。脊柱椎体骨折的主要原因体内钙流失过多，骨质疏松较为严重,其椎间盘组织中二聚糖异常降低。脊柱椎体终板损伤可引起椎间盘退行性变，骨质疏松是造成脊柱压缩性骨折重要病因，椎间盘病理检查常出现二聚糖、水分及蛋白多糖含量减少的现象[8]。正常情况下，二聚糖通过抑制炎性因子白介素-l的合成，激活细胞外调节蛋白通路来参与调节椎间盘新陈代谢，达到抑制椎间盘退行性的目的[9]。而VEGF作为促血管生长因子，在促进血管内皮细胞增殖迁移及再生、参与骨折部位动脉侧支循环，在骨折的愈合过程中发挥着重要调节作用[10]。

本实验设计选取的穴位以经穴体系为理论依据，有关腧穴采用鹿瓜多肽穴位注射。这种治疗方法是以经络为载体，使针、药、穴的综合作用于骨折处所支配的神经，明显提高药物吸收和药物治疗作用[11]。实验中所选用的“夹脊穴、血海、足三里、阳陵泉”等诸穴均为经典的治疗椎间盘退行性腧穴，刺激后可起到疏风通络、行气止痛之功效[12]。本实验观察发现，与模型组比较,鹿瓜多肽小/大剂量组在治疗21 d后，其VEGF、VEGF mRNA、二聚糖及骨密度均明显升高。从实验结果来看，穴位注射鹿瓜多肽可促进兔L1–L5节段椎体损伤时VEGF分秘及VEGF mRNA表达。本研究认为，VEGF及VEGF mRNA参与了椎体损伤后的修复，在这个过程中，鹿瓜多肽可能刺激了VEGF分泌，促进骨折血管的新生，增加损伤局部的血供，有利于骨折愈合。有报导，鹿瓜多肽可诱导骨折愈合过程中VEGF分泌及VEGF mRNA表达[13-14]，这与本实验观察到的现象高度一致。另一方面，鹿瓜多肽小/大剂量组兔L1–L5节段椎间盘组织中二聚糖及骨密度均明显升高，这是由于注射用鹿瓜多肽具有多种生物活性，其骨诱导多肽类生物因子促进了机体内影响骨形成和吸收的骨源性生长因子的合成，包括骨形态发生蛋白（bone morphogenetic protein，BMP）及成纤维细胞生长因子等，这些成分可促进骨折部位细胞有丝分裂、分化及趋化作用[15]。研究表明，BMP参与调节细胞外基质、增强软骨细胞和成骨细胞分化，增加骨钙素的合成、促进新骨及骨痂形成[16]。注射用鹿瓜多肽可增加骨钙沉积，故鹿瓜多肽小/大剂量组兔L1–L5节段动物椎体骨密度高于模型组。另外，注射用鹿瓜多肽中的成纤维细胞生长因子能降低骨折局部毛细血管通透性，抑制机体前列腺素E2的合成与释放，减轻炎性浸润而达到止痛作用[17]。有研究表明，在促进骨折早期愈合过程中，注射用鹿瓜多肽中的骨诱导多肽生物因子还可促进骨原性生长因子的合成，调节钙磷代谢、增加骨钙沉积而提高骨密度[18]。

注射用鹿瓜多肽治疗椎体骨折的机制可能为，穴位注射可促进兔L1–L5节段椎体骨折愈合过程中VEGF的合成分泌，促使骨折椎体血管内皮新生，调节椎间盘组织细胞代谢并维持平衡，提高骨折椎间盘二聚糖黏附细胞数量，降低骨折局部毛细血管通透性，减少炎性浸润及渗出，增加椎间盘二聚糖的分泌与合成，降低破骨细胞分化从而诱导新骨及骨痂形成，而达到促进骨折修复的作用。