环孢霉素A诱导大鼠心肌纤维化和对基质金属蛋白酶及其抑制剂表达的影响*

赵 丽， 尹新华

(1复旦大学附属妇产科医院心血管内科， 上海 200011； 2哈尔滨医科大学附属第一医院心血管内科， 黑龙江 哈尔滨 150081)

环孢霉素A(cyclosporine A，CsA)作为有效的免疫抑制剂自应用于临床以来促进了器官移植的巨大发展[1]，同时还用于肾病综合症和系统性红斑狼疮等自身免疫性疾病的治疗[2-3]。但随着CsA临床应用的深入，研究者发现其对心、肝和肾等脏器具有毒性作用[4];近年来发现其亦可导致心肌损伤;我们既往的研究和相关报道也指出其具有心肌损伤作用，并可导致心肌纤维化[5]。到目前为止，CsA导致心肌损伤和心肌纤维化的研究较少，而且其相关机制并不明确。有研究认为心肌纤维化与基质金属蛋白酶/金属蛋白酶组织抑制物(matrix metalloproteinases/tissue inhibitor of metalloproteinases，MMPs/TIMPs)的失衡有关[6]。MMPs/TIMPs表达的变化体现在人体的多种病变过程中，在组织重塑、细胞迁移、血管生成和炎症等过程中发挥重要作用[7]。本研究的目的在于探讨CsA诱导的心肌纤维化与TIMPs/MMPs的关系和CsA诱导心肌纤维化的发生机制，为CsA在临床长期安全应用提供理论依据。

材 料 和 方 法

1 设计类型

本研究设计类型为4×3析因设计，其中A因素为环孢霉素A,B因素为时间，A因素有4个水平(0、低剂量、中剂量和高剂量)，B因素有3个水平(第1周、第2周和第3周)。

2 动物及分组

SPF级健康雌性6～8周龄Wistar大鼠，体重(200±25) g，购自哈尔滨医科大学动物实验中心,动物合格证号为；SCXK(黑)2008-002。将CsA注射液(250 mg/5 mL)溶于生理盐水中，大鼠随机分为4组，对照(control)组、CsA低剂量(low dose)组、中剂量(middle dose)组和高剂量(high dose)组。对照组给予腹腔注射生理盐水1 mL，CsA各剂量组分别给予腹腔注射 5、12.5和25 mg·kg-1·d-1CsA。分别在第1、2和3 周时腹腔注射10%水合氯醛(30 mL/kg)，在大鼠行麻醉手术后，开胸迅速取出心脏，利用磷酸盐缓冲液(pH 7.4)清洗。应用HE染色观察心肌组织形态结构、Masson染色观察心肌胶原沉积情况及心肌纤维化的程度、免疫组织化学和Western blot法检测MMP2、MMP9、TIMP1和TIMP2蛋白的表达情况。本研究经过哈尔滨医科大学动物伦理委员会审核批准。

3 主要试剂及仪器

CsA注射液购自哈尔滨血液研究所；多聚甲醛购自Sigma；抗MMP2、MMP9、TIMP1和TIMP2 的I 抗及 II 抗试剂盒购自上海志立生物科技有限公司；RIPA组织细胞快速裂解液、BCA蛋白定量试剂盒、30%丙烯酰胺(29∶1)、1.0 mol/L Tris-HCl (pH 8.8)电泳缓冲液、1.0 mol/L Tris-HCl (pH 6.8)电泳缓冲液、10% SDS和10% 过硫酸铵购自上海基尔顿生物有限公司；蛋白预染Marker购自Fermentas；NC膜和发光液购自Millipore；抗MMP2、MMP9、TIMP1和TIMP2抗体购自Abcam；抗GAPDH抗体购自CST；羊抗兔HRP标记 II 抗、驴抗山羊HRP标记 II 抗和羊抗鼠HRP标记 II 抗购自碧云天生物科技有限公司。电泳仪(Mini Protean 3 Cell)购自Bio-Rad；电转仪(PS-9)购自大连竞迈科技有限公司；Tanon-5200成像系统(Tanon)； 光学显微镜(Olympus)；Images Advanced 3.0病理摄片系统(Motic)。

4 主要方法

4.1HE染色观察心肌组织形态结构及纤维化程度 用手术刀片在大鼠心脏中下1/3交界处沿心脏横轴切开，保留左右心室至心尖部，将切取的心脏置于多聚甲醛溶液中，静止48 h，准备制作蜡块；其余心脏组织立即液氮速冻。将多聚甲醛中心肌组织制成约4 mm×4 mm×4 mm大小的组织块，用10%甲醛常温下固定24 h后流水冲洗，然后逐级乙醛脱水，二甲苯透明，浸蜡，石蜡包埋，用光学切片机连续切取全心切片。经过染色，分色，中性树胶固片后，在光学显微镜下观察。

4.2Masson染色观察心肌胶原沉积情况 切片在二甲苯中脱蜡10 min，移入二甲苯和乙醇(1∶1)混合液中5 min。乙醇梯度密度脱水。0.5%的苏木素染色10 min，水洗后1%的盐酸乙醇分色60 s再水洗，用1/400氨水促蓝并水洗至无氨味，用橘黄G媒染60 s，用水快速洗，丽春红染色5 min水洗2 min，1%的磷钨酸分色6 min，水快速洗，甲基蓝染色10 min，水洗干净，95%的乙醇分色40 s，100%的乙醇脱水2次，每次3 min，二甲苯透明2次，每次10 min，树胶封片。胶原纤维染成蓝色，胞质、肌细胞和红细胞染成红色，胞核染成蓝褐色。采用医学图像分析系统，测量心肌胶原容积分数(collagen volume fraction，CVF)，CVF=心肌间质胶原面积/所测视野面积。每张心肌切片标本均随机取5个视野(×400)测量，取平均值，对心肌间质进行胶原定性及半定量分析。

4.3免疫组织化学检测MMPs/TIMPs蛋白的表达 蜡块切片于80 ℃烤箱中烤片5 min，二甲苯脱蜡3次，每次10 min，梯度乙醇脱水各10 min，蒸馏水冲洗2次。配制新鲜的3%的过氧化氢液，阻断内源性过氧化物酶10 min。蒸馏水冲洗2次，加抗原修复液，高压修复，室温冷却。蒸馏水冲洗1次，PBS冲洗3次各5 min，准备湿盒，擦片后加 I 抗，4 ℃过夜。4 ℃冰箱取出湿盒，PBS冲洗3次各5 min；擦片，加 II 抗，每片50 μL左右；室温下静置20 min，PBS冲洗3次，每次5 min， DAB镜下显色。自来水冲洗5 min，苏木素复染，自来水冲洗10 min，梯度乙醇脱水各3 min，二甲苯透明各5 min，封片。细胞核染成蓝色，心肌细胞及间质淡染，MMP2、MMP9、TIMP1和TIMP2蛋白染成棕色，呈细颗粒状，在细胞质内表达，采用医学图像分析系统，测量积分吸光度(integrated absorbance，IA)。每张心肌切片标本均随机取5个视野(×400)测量，取平均值。

4.4Western blot检测MMPs/TIMPs蛋白的表达 将大鼠心肌组织剪成细小的碎片，按每20 mg组织加入250 μL裂解液的比例加入裂解液(裂解液中加入蛋白酶和磷酸酶抑制剂)，匀浆器匀浆直至完全裂解。裂解后的样品4 ℃、12 000×g离心15 min，取上清，进行BCA蛋白定量后贮存于-80 ℃冰箱。根据目的蛋白的分子量选择不同的凝胶浓度。每孔上样量约为50 μg蛋白。根据蛋白定量结果取所需蛋白加入适量上样缓冲液，沸水浴10 min后离心取上清上样。将配制好的PAGE胶放入电泳槽中，加入适量电泳缓冲液。将样品缓慢加到对应的孔内，注意勿溢出加样孔。浓缩胶80 V，20 min，分离胶120 V，60 min。通过半干式转膜，25 V转膜30 min。封闭4 ℃过夜。根据说明书，各抗体稀释度为 1∶1 000(MMP2、MMP9和TIMP2)、 1∶500(TIMP1)和1∶2 000(GAPDH,用作内参照)，抗体加入封闭液中稀释到所需浓度，4 ℃孵育过夜。孵育 I 抗的膜用TBST洗涤3次，每次5 min。随后根据用量，按照1∶1 000稀释HRP标记的 II 抗，与膜37 ℃孵育1 h。用TBST洗涤3次，每次5 min。最后通过Tanon-5200成像系统进行ECL化学发光检测。

5 统计学处理

采用SPSS 19.0软件进行统计分析。计量资料采用均数±标准差(mean±SD)表示，组间比较采用4×3析因设计方差分析、多元方差分析及SNK多重比较，分析处理因素和时间因素之间的交互作用、主效应和单独效应。以P<0.05为差异有统计学意义。

结 果

1 动物模型复制结果

给予 CsA 后，大鼠相继出现进食和饮水减少，毛发光泽减少，稀疏脱落，精神萎糜不振，体重明显减轻，注射第2周，高剂量组大鼠死亡2只；注射第3周，中剂量组和高剂量组各死亡1只。剖检死亡大鼠，可见肝脓肿和肺脓肿。症状表现及死亡率与剂量相关。

2 HE染色结果

在第3周，对照组大鼠心肌细胞呈椭圆形，细胞核大，呈圆形或椭圆形，位于细胞中央，染色均匀，肌浆丰富；CsA低剂量组心肌细胞出现不同程度的水肿，胞浆嗜酸性改变、呈细颗粒状，心肌细胞空泡变；CsA中剂量组部分心肌横纹消失，核浓缩，心肌灶状坏死，出现间质纤维化；CsA高剂量组出现明显的心肌细胞纤维化。CsA用药组心肌组织病理损伤随剂量增加和时间延长而加重，见图1。

3 Masson染色结果

对照组心肌细胞排列规则、细胞浆均染、细胞大小均等，心肌间质见少量正常纤维化。CsA低剂量组心肌细胞排列紊乱，部分心肌细胞体积缩小，血管周围纤维化增加，部分间质可见纤维化，CVF值较对照组明显增高(P<0.05)，有明显胶原沉积。CsA中剂量组心肌细胞排列紊乱加重，部分心肌细胞凋亡明显，可见体积缩小的心肌细胞的数量增多，胶原沉积的面积增加(P<0.05)，纤维化从血管周围向间质延伸。CsA高剂量组心肌细胞损伤最重，心肌细胞可见大面积的凋亡坏死，可见已经坏死凋亡的区域有胶原大量沉积(P<0.05)，被纤维化所替代，间质纤维化程度重，并可见炎症细胞浸润，见图2、表1。

Figure 1.The images of the myocardium with HE staining at the 3rd week of CsA exposure (×400).

图1CsA作用第3周各实验组大鼠心肌组织的HE染色观察

Figure 2.The images of the myocardium with Masson staining at the 3rd week of CsA exposure (×400).

图2CsA作用第3周各实验组心肌组织的Masson染色观察

表1 CsA对大鼠心肌纤维化的影响

*P<0.05vscontrol group;#P<0.05vsCsA (low dose) group.

4 免疫组织化学检测MMPs/TIMPs蛋白表达结果

4.1MMP2蛋白表达结果 对照组细胞质内仅见极少量的染成棕色的MMP2蛋白。CsA各剂量组的IA值明显高于对照组(P<0.05)，相同剂量CsA组随用药时间的延长,IA值均表现出由第1周时的高峰逐渐下降、第3周时达到最低的相同变化规律(P<0.05)，见图3、表2。

4.2TIMP2蛋白表达结果 对照组各时点细胞质内仅见极少量棕染的TIMP2蛋白。CsA在导致大鼠心肌纤维化过程中TIMP2蛋白的表达增加(P<0.05)，大部分TIMP2蛋白的IA值表现出在同一剂量下较前一用药时点显著升高，同一用药时点较前一CsA用药组剂量的差异有统计学显著性(P<0.05),见图4、表3。

4.3MMP9蛋白表达结果 对照组细胞质内有大量棕染的MMP9蛋白，表明MMP9的表达水平增高。各用药组在第1周时IA值明显减低(P<0.05)，第2周时增高，第3周时又明显下降，此时也可以看到胞浆内细颗粒状棕染部分随用药时间的延长而变化。同一时间，各用药组表达水平的差异部分有统计学显著性(P<0.05),见图5、表4。

Figure 3.The expression of MMP2 in the myocardial tissues of different groups was detected by the method of immunohistochemistry at the 3rd week of CsA exposure (×400).

图3CsA作用第3周各实验组MMP2免疫组织化学检测结果

表2CsA诱导大鼠心肌纤维化时MMP2蛋白的表达

Table 2.The expression of MMP2 protein in the myocardium with CsA-induced fibrosis determined by immunohistochemical staining (Mean±SD.n=5)

Group IA1st week2nd week3rd weekControl43.11±17.3425.79±8.3961.49±33.09CsA (low dose)1 367.10±418.08*1 097.60±376.77*553.59±185.22*△CsA (middle dose)1 768.10±195.49*872.03±154.55*▲521.98±207.58*△CsA (high dose)1 604.60±490.81*1 270.80±269.11*935.04±306.94*#△

*P<0.05vscontrol group;#P<0.05vsCsA (middle dose) group;▲P<0.05vs1st week;△P<0.05vs2nd week.

Figure 4.The expression of TIMP2 in the myocardial tissues of different groups was detected by the method of immunohistochemistry at the 3rd week of CsA exposure (×400).

图4CsA作用第3周各实验组TIMP2免疫组织化学检测结果

表3CsA诱导大鼠心肌纤维化时TIMP2蛋白的表达

Table 3.The protein expression of TIMP2 in the myocardium with CsA-induced fibrosis determined by immunohistochemical staining (Mean±SD.n=5)

Group IA1st week2nd week3rd weekControl154.56±33.4634.04±12.1632.14±9.00CsA (low dose)1 323.03±325.02*2 035.95±287.81*▲1 565.50±404.02*△CsA (middle dose)1 150.80±181.54*1 049.40±308.43*&1 590.40±278.32*&△CsA (high dose)855.39±162.45*#2 157.50±272.75*#▲3 606.80±381.11*#△

*P<0.05vscontrol group;&P<0.05vsCsA (low dose) group;#P<0.05vsCsA (middle dose) group;▲P<0.05vs1st week;△P<0.05vs2nd week.

Figure 5.The expression of MMP9 in the myocardial tissues of different groups was detected by the method of immunohistochemistry at the 3rd week of CsA exposure (×400).

图5CsA作用第3周各实验组MMP9免疫组织化学检测结果

4.4TIMP1蛋白表达结果 对照组在各时点的细胞质内可见大量棕染的TIMP1蛋白，与对照组相比，CsA用药组的IA值明显减低(P<0.05)，各用药组在1周时TIMP1蛋白的IA值明显减低，第2周时增高，第3周时又明显下降(P<0.05)，第2周和第3周时，CsA高剂量组与CsA低剂量组相比IA值有明显增加(P<0.05),见图6、表5。

表4CsA诱导大鼠心肌纤维化时MMP9蛋白的表达

Table 4.The protein expression of MMP9 in the myocardum with CsA-induced fibrosis determined by immunohistochemical staining (Mean±SD.n=5)

Group IA1st week2nd week3rd weekControl3 800.10±798.024 093.60±586.254 212.80±355.22CsA (low dose)2 060.40±365.55*4 107.30±613.07▲1 585.50±402.36*△CsA (middle dose)3 172.30±481.61*&4 455.40±478.78▲1 883.30±286.63*△CsA (high dose)2 113.60±346.55*#4 079.00±515.87▲2 022.50±633.32*△

*P<0.05vscontrol group;&P<0.05vsCsA (low dose) group;#P<0.05vsCsA (middle dose) group;▲P<0.05vs1st week;△P<0.05vs2nd week.

Figure 6.The expression of TIMP1 in the myocardial tissues of different groups was detected by the method of immunohistochemistry at the 3rd week of CsA exposure (×400).

图6CsA作用第3周各实验组TIMP1免疫组织化学检测结果

表5CsA诱导大鼠心肌纤维化时TIMP1蛋白的表达

Table 5.The protein expression of TIMP1 in the myocardium with CsA-induced fibrosis determined by immunohistochemical staining (Mean±SD.n=5)

Group IA1st week2nd week3rd weekControl3 568.00±413.723 107.30±496.012 738.80±200.78CsA (low dose)798.95±190.04*1 504.30±496.98*▲774.13±206.99*△CsA (middle dose)965.88±387.74*1 094.71±271.89*643.68±155.86*&CsA (high dose)1 048.99±178.91*1 807.30±289.35*#▲1 266.20±237.74*#△

*P<0.05vscontrol group;&P<0.05vsCsA (low dose) group;#P<0.05vsCsA (middle dose) group;▲P<0.05vs1st week;△P<0.05vs2nd week.

5 Western blot检测MMPs/TIMPs蛋白的表达结果

5.1MMP2蛋白表达结果 各用药组与对照组比较表达明显增高(P<0.05)；各用药组在第1周高表达，随时间延长表达逐渐减低(P<0.05)；同一时点，各用药组随剂量增加表达增高(P<0.05),见图7、表6。

5.2TIMP2蛋白表达结果 各用药组与对照组比较表达明显增高(P<0.05)；各用药组随时间延长表达逐渐增高(P<0.05)；同一时点，各用药组随剂量增加表达增高(P<0.05),见图7、表7。

5.3MMP9蛋白表达结果 各用药组与对照组比较表达减低(P<0.05)；各用药组在第1周低表达，第2周表达增高，第3周表达降低(P<0.05)；同一时点，各用药组表达变化的差异无统计学显著性(P>0.05),见图7、表8。

5.4TIMP1蛋白表达结果 部分用药组与对照组比较表达减低(P<0.05)；各用药组在各时点变化不具有统计学意义；同一时点，部分用药组随CsA剂量的增加表达增高(P<0.05)，见图7、表9。

讨 论

心脏移植是目前治疗终末期心脏病重要而有效的方法，CsA 是心脏移植后常用的免疫抑制剂，但其肝、肾脏毒性特别是致心肌损伤的副作用甚至是心肌纤维化已经限制了其临床应用，本研究的目的在于探讨CsA诱导的心肌纤维化与TIMPs、MMPs关系和CsA诱导心肌纤维化的发生机制。心脏间质主要由细胞外基质构成，包括胶原和蛋白多糖等，其中I、III型胶原是细胞外基质的主要成分[8]。正常生理情况下，胶原的合成和降解处于动态的平衡当中，当胶原合成增加或降解减少时均可引起胶原的沉积，而降解大于合成时，则会破坏胶原的网络结构[9]，导致纤维化的发生。MMPs/TIMPs是胶原的降解系统，其中MMPs/TIMPs表达的改变或MMPs/TIMPs比例失衡都可以导致胶原的合成和降解异常，从而引起心室重构、心肌纤维化[10]。若MMPs过表达或MMPs/TIMPs比值增高，则使胶原过度降解，由缺乏连接结构的纤维所取代而引起心室壁变薄、心腔扩大。若MMPs低表达或MMPs/TIMPs比值减低，则胶原的合成大于降解而使胶原过度沉积，导致心室壁增厚，心肌的重量明显增加[11]。因此，MMPs和TIMPs表达的变化贯穿于心室重构、心肌纤维化的全部过程，不同的发展阶段，其表达有不同的特征。

Figure 7.The images of Western blot for determining the protein expression levels of MMP2, MMP9, TIMP2 and TIMP1 in the myocardium in different groups at different time points. C: control group; L: low dose of CsA group; M: middle dose of CsA group; H: high dose of CsA group. C1, L1, M1 and H1: corresponding groups at the 1st week; C2, L2, M2 and H2: corresponding groups at the 2nd week; C3, L3, M3 and H3: corresponding groups at the 3rd week.

图7Westernblot检测不同时点和组别心肌组织MMP2、MMP9、TIMP2和TIMP1蛋白的相对表达量

我们的研究发现，MMPs、TIMPs及MMPs/TIMPs在CsA诱导的大鼠心肌纤维化的发生发展过程中呈阶段性的变化。CsA各用药组第1周时即有心肌细胞不同程度的水肿，胞浆嗜酸性改变，随用药时间延长部分心肌横纹消失，核浓缩、心肌灶状坏死，心肌细胞体积缩小、凋亡、胶原逐渐沉积，间质纤维化；同时大剂量组短时间和低剂量组长时间用药也出现了明显的纤维化。MMP2在CsA诱导的大鼠心肌纤维化的初期即有高表达，其表达达到高峰，而随着给药时间的延长其表达量逐渐减少，但较对照组相比表达仍增高。我们推测心肌在CsA长时间大剂量的作用下产生大量的氧自由基及各种细胞因子和生长因子，如白细胞介素和肿瘤坏死因子及转化生长因子等，在这些因素的作用下刺激成纤维细胞分泌合成大量的胶原，同时也分泌合成MMP2来降解过多的胶原。随着损伤的持续存在，过高表达的MMP2又可刺激组织产生肿瘤坏死因子及转化生长因子等，使胶原合成增加，形成恶性循环，最终胶原合成的速率大于降解的速率而发生胶原沉积，结果是同一剂量组其降解在病理性损伤的早期阶段被激活并达到高峰，在纤维化形成阶段被抑制。而同一时点，随剂量的增加，其降解在高剂量组也达到高峰。研究结果提示MMP2不仅在胶原的降解过程中起重要作用，也参与了胶原合成的调节，结果是MMP2表达增高的同时伴有纤维化的发生。TIMP2作为MMPs的内源性的组织性抑制剂，抑制除了MMP9以外的所有的MMPs，对MMP2具有特异性[12]。TIMPs除了具有抑制MMPs的作用外，还具有生长因子样作用及调控细胞增殖和凋亡的作用。在组织中，TIMP2的表达只受MMP2的影响，随MMP2表达的改变而变化。同一剂量组在CsA诱导的大鼠心肌纤维化的初期其表达增高，在纤维化形成的过程当中逐渐增高，与MMP2相比，纤维化初始阶段其表达低于MMP2，在纤维化形成时其表达高于MMP2。在纤维化的初期TIMP2为抑制MMP2的过表达其合成和分泌也增加，随用药时间的延长，TIMP2的合成和分泌大于MMP2的量，而使降解减少，胶原的合成大于降解，发生纤维化，也说明TIMP2与MMP2表达的不同步即两者之间存在失衡；从同一时点观察，两者的失衡导致的纤维化也很明显。TIMP2与MMP2表达的不同步即两者的失衡导致纤维化除了上述原因外，也与TIMPs-MMPs形成复合物在一定条件下再激活MMPs有关。转化生长因子可促进I、II及Ⅳ型胶原和蛋白多糖的合成，抑制细胞外基质的降解，促进TIMPs的表达，促进整合素的表达，增强细胞-基质的相互作用。以上因素共同促进了TIMP2的过表达，而 MMP2/TIMP2失衡，导致了纤维化的发生发展。

表6CsA诱导大鼠心肌纤维化时MMP2蛋白的表达

Table 6.The protein expression of MMP2 in the myocardium with CsA-induced fibrosis determined by Western blot (Mean±SD.n=3)

Group Relative protein expression (MMP2/GAPDH)1st week2nd week3rd weekControl0.132±0.0060.146±0.0050.117±0.009CsA (low dose)0.365±0.006*0.346±0.011*▲0.250±0.010*△CsA (middle dose)0.554±0.009*&0.514±0.020*&▲0.445±0.011*&△CsA (high dose)0.602±0.013*#0.556±0.009*#▲0.509±0.008*#△

*P<0.05vscontrol group;&P<0.05vsCsA (low dose) group;#P<0.05vsCsA (middle dose) group;▲P<0.05vs1st week;△P<0.05vs2nd week.

表7CsA诱导大鼠心肌纤维化时TIMP2蛋白的表达

Table 7.The protein expression of TIMP2 in the myocardium with CsA-induced fibrosis determined by Western blot (Mean±SD.n=3)

Group Relative protein expression (TIMP2/GAPDH)1st week2nd week3rd weekControl0.174±0.0060.157±0.0070.144±0.009CsA (low dose)0.313±0.009*0.458±0.034*▲0.543±0.007*△CsA (middle dose)0.440±0.017*&0.569±0.020*&▲0.662±0.015*&△CsA (high dose)0.472±0.008*#0.662±0.012*#▲0.756±0.036*#△

*P<0.05vscontrol group;&P<0.05vsCsA (low dose) group;#P<0.05vsCsA (middle dose) group;▲P<0.05vs1st week;△P<0.05vs2nd week.

表8CsA诱导大鼠心肌纤维化时MMP9蛋白的表达

Table 8.The protein expression of MMP9 in the myocardium with CsA-induced fibrosis determined by Western blot (Mean±SD.n=3)

Group Relative protein expression (MMP9/GAPDH)1st week2nd week3rd weekControl0.964±0.0360.933±0.0240.848±0.031CsA (low dose)0.404±0.010*0.719±0.023*▲0.291±0.012*△CsA (middle dose)0.420±0.012*0.726±0.008*▲0.264±0.012*△CsA (high dose)0.345±0.008*0.687±0.015*▲0.297±0.008*△

*P<0.05vscontrol group;▲P<0.05vs1st week;△P<0.05vs2nd week.

表9CsA诱导大鼠心肌纤维化时TIMP1蛋白的表达

Table 9.The protein expression of TIMP1 in the myocardium with CsA-induced fibrosis determined by Western blot (Mean±SD.n=3)

Group Relative protein expression (TIMP1/GAPDH)1st week2nd week3rd weekControl0.697±0.0250.707±0.0340.562±0.176CsA (low dose)0.421±0.132*0.464±0.1380.373±0.120CsA (middle dose)0.528±0.0930.537±0.091*0.463±0.070CsA (high dose)0.573±0.080#0.612±0.048#0.557±0.017

*P<0.05vscontrol group;#P<0.05vsCsA (middle dose) group.

CsA各用药组的MMP9蛋白表达在第1周时下降，随后第2周时升高，第3周时又下降的趋势。而TIMP1作为MMPs的组织性抑制剂，也表现出同样的趋势。López 等[13]通过组织活检也发现高血压患者血浆 TIMP1 水平与心肌纤维化程度有着直接关系。TIMP1作为MMPs的组织性抑制剂，其作用是降解除MMP2、膜型MMP外所有的MMPs，对MMP9具有特异性[14]。多数研究认为，MMP2/TIMP2与心肌肥厚、心肌纤维化相关，而MMP9/TIMP1与心脏扩大的关系更密切。从我们的实验结果可以看出，在纤维化初期，MMP2的表达增高更明显，且在纤维化的形成过程中MMP2/TIMP2的变化与之关系更紧密，因此也可以解释在纤维化初期时MMP9表达降低的原因。但随着用药时间的延长、损伤的加重，基膜和弹力纤维的降解也增加，同时已激活的MMPs之间也可以相互激活，因此MMP9的表达也增高，TIMP1为抑制MMP9的表达其分泌也增加，说明两者在纤维化的形成中也起一定的作用。但随着胶原逐渐沉积、纤维化程度逐渐加重，MMP9和TIMP1转而下降，故认为MMP9和TIMP1可能在以后心室的扩张中起更关键的作用。我们也发现，同一时间，TIMP1增高的趋势大于MMP9，说明随剂量的增加，MMP9/TIMP1的失衡同样也参与了纤维化的发生发展。

综上所述，MMP2、TIMP2、MMP9和TIMP1表达的变化及MMPs/TIMPs的失衡在CsA致大鼠心肌纤维化的过程中起重要作用。其致纤维化的作用机制主要是MMPs、TIMPs的自我调节和相互影响。因此可以通过纠正MMPs/TIMP的失衡，抑制由CsA引起的心肌纤维化，从而达到修复心肌功能的目的。