盐酸小檗碱通过PI3K/Akt信号通路促进小鼠前成骨细胞MC3T3-E1的分化*

江 健， 廖莉娅， 容 婵， 陈捷侨， Ashish SHRESTHA， 刘星琦， 苏 雅， 舒晓春△

(1中山大学附属第五医院， 广东 珠海 519000； 2南方医科大学附属顺德医院， 广东 佛山 528300)

骨质疏松症(osteoporosis)是最常见的代谢性骨骼疾病，其特点是骨量减低，骨质强度减弱，骨微结构破坏，从而骨折的风险增加[1]。随着人口老龄化的不断增加，我国作为世界上老年人口绝对数最大的国家，正面临着骨质疏松症高患病率的严峻的挑战，据统计，我国50岁以上人群骨质疏松症患病率女性为20.7%，男性为14.4%[2]。目前治疗骨质疏松症的药物主要是抑制骨吸收药物，包括双膦酸盐、降钙素和雌激素[3]。然而，有研究表明这些药物的使用可能引起一些副作用，包括骨坏死、非典型股骨骨折和食道癌等[4]。因此，探索更加安全、健康的天然药物来治疗骨质疏松显得尤为重要，已有研究发现一些天然药物，如骨碎补总黄酮、淫羊藿苷和盐酸小檗碱等都有促进成骨分化和抗骨质疏松的潜能[5-7]。磷脂酰肌醇3-激酶(phosphatidylinositol 3-kinase,PI3K)通路是与新陈代谢、增殖、分化及凋亡关系密切的信号通路[8]，蛋白激酶B(protein kinase B, PKB/Akt)是PI3K激活的主要信号分子，它随后通过磷酸化对下游的多种物质产生作用[9]。此外，PI3K/Akt信号通路在成骨和破骨细胞的形成、分化以及氧化损伤的调节中起着重要作用[10-13]。盐酸小檗碱(berberine，BBR)是一种生物碱，如今，关于BBR促进成骨细胞分化的作用机制仍不是十分清楚。本研究通过探讨BBR对前成骨细胞分化与矿化的影响，检测成骨细胞相关分化分子的表达情况，并探讨其机制是否与BBR激活PI3K/Akt信号通路有关，为进一步促进黄连素的临床应用提供实验依据。

材 料 和 方 法

1 材料

1.1细胞 小鼠前成骨细胞系MC3T3-E1由南方医科大学提供。

1.2药物和主要试剂 盐酸小檗碱(纯度>98%)购于东京化成工业株式会社；PI3K/Akt 信号通路特异性抑制剂LY294002(碧云天生物公司)；α-MEM细胞培养基(Gibco)；四季青胎牛血清(浙江天航生物科技有限公司)； CCK-8试剂盒(同仁化学研究所)；BCA蛋白检测试剂盒(凯基生物公司)；碱性磷酸酶(alkaline phosphatase, ALP)活性检测试剂盒(南京建成生物公司)；real-time PCR所用引物及定量检测SYBR Green(上海生物工程公司);茜素红S染液(翔博生物公司)；抗体β-actin (Santa Cruz);抗体p-Akt(CST)；羊抗小鼠及羊抗兔Ⅱ抗(Abclonal)；极超敏ECL化学发光试剂盒(碧云天生物公司)。

2 主要方法

2.1前成骨细胞MC3T3-E1的培养 细胞复苏后加入4 mL完全培养基，置于37 ℃、CO2体积分数为5%的培养箱中培养，每2 d换液一次，显微镜观察细胞生长状况，待细胞生长融合到80%后，PBS洗2遍，加入0.25%胰蛋白酶2 mL，37 ℃静置1 min, 加入4 mL完全培养基终止消化，800 r/min离心5 min，弃上清, 加入4 mL完全培养基重悬细胞，接种到培养瓶中，37 ℃、CO2体积分数为5%的培养箱中静置培养。

2.2细胞活性测定 细胞接种在96孔板中，密度为每孔3 000个细胞，待细胞基本融合后，采用不同浓度(0,1,5,10和20 mg/L)的盐酸小檗碱进行干预，3 d后，使用CCK-8试剂盒检测细胞活性。每孔加入含10% CCK-8试剂的培养基100 μL，37 ℃孵育4 h，酶标仪选择450 nm波长检测其吸光度(A)值。计算细胞活性，结果用与对照组的百分比表示。

2.3碱性磷酸酶活性的测定 MC3T3-E1细胞按1×108cells/L的密度接种2 mL于6孔板中，待细胞融合至80%，加不同浓度(0、1、5、10和20 mg/L)的盐酸小檗碱分别培养3 d和7 d，每2 d更换一次培养基。测定步骤参照ALP检测试剂盒提供的方法：弃除培养基后，PBS清洗2遍，加入含有1% Triton X-100的细胞裂解200 μL，冰上裂解30 min，低温离心机4 ℃、12 000 r/min离心15 min。取上清液用BCA蛋白试剂盒测定蛋白浓度，用ALP检测试剂盒在酶标仪波长520 nm处检测其A值，计算碱性磷酸酶活性。

2.4成骨细胞分化相关因子mRNA水平表达情况的测定 成骨细胞分化相关因子ALP、骨钙素(osteocalcin， OCN)、骨桥蛋白(osteopontin， OPN)及Runt相关转录因子2(Runt-related transcription factor 2， Runx2)是成骨分化实验重要的检测指标。本实验将前成骨细胞按1×108cells/L密度接种2 mL于6孔板中培养，待细胞基本融合后，实验分为对照(control)组，BBR组，BBR+LY249002组和LY249002组，BBR+LY249002组及LY249002组加入含抑制剂(10 mmol/L LY294002)的无血清培养基预处理1 h，吸净培养液，后分别加入含药(5 mg/L BBR)培养基和普通培养基，培养48 h，后用PBS洗2遍，加入200 μL TRIzol reagent提取细胞总RNA。逆转录试剂盒购于TaKaRa，每10 μL的逆转录体系含总RNA 600 ng。Real-time PCR分析采用SYBR Green real-time PCR试剂盒，引物如表1所示，反应条件： 95 ℃ 3 min; 95 ℃ 15 s， 60 ℃ 30 s，共40个循环。GAPDH作为内参照，数据使用2-ΔΔCt方法进行分析。

表1 Real-time PCR引物序列

2.5Western blot检测PI3K/Akt通路相关蛋白的表达 细胞按1×108cells/L的密度接种4 mL于直径为60 mm的培养皿中，待细胞融合至80%后，对各实验组(对照组、BBR组、BBR+LY249002组和LY249002组)做相应的处理，药物干预48 h后，用PBS洗2遍，加入200 μL的细胞蛋白裂解液(含1%蛋白酶抑制剂和1%磷酸酶抑制剂)，冰上裂解30 min。4 ℃、12 000×g离心15 min，收集上清液。用BCA蛋白试剂盒测定蛋白浓度，加入上样缓冲液在100 ℃加热10 min进行蛋白变性。每孔加入等量的蛋白质(10 μg)进行10% SDS-PACE，200 mA转膜120 min。QuickBlockTM封闭液封闭30 min，加入Ⅰ抗4 ℃条件下孵育过夜，TBST洗膜3次，首次15 min，其余10 min，加入Ⅱ抗孵育1 h,TBST清洗3次。用ECL进行发光显影，通过蛋白条带灰度分析进行定量测定。

2.6茜素红S染色及半定量测定 MC3T3-E1细胞按2×107cells/L的密度接种1 mL于24孔板中，普通培养基培养24 h，分为4个处理组(对照组、BBR组、BBR+LY249002组和LY249002组)，经过药物和抑制剂处理以后加入细胞诱导分化培养基(10 mmol/L β-甘油磷酸钠和50 mg/L抗坏血酸)培养21 d，培养基每2 d换一次，诱导分化完成后，PBS冲洗2遍，用70%乙醇固定1 h，后PBS冲洗3遍，用茜素红S染液(40 mmol/L,pH 4.2)37 ℃染色1 h。染色完成后用无钙、镁离子的PBS冲洗5遍，显微镜下观察矿化结节形成情况。用100 nmol/L的氯化十六烷基吡啶溶液溶解染色后的矿化结节，并用酶标仪在波长为540 nmol/L处测定各实验组的A值。

3 统计处理

采用SPSS 20.0软件进行单因素方差分析，结果以均值±标准差(mean±SD)表示。以P<0.05为差异具有统计学意义。

结 果

1 盐酸小檗碱在一定浓度内对MC3T3-E1细胞活性无影响

CCK-8实验结果显示，与对照组比较，不同浓度盐酸小檗碱干预后，细胞活性没有明显差异，见图1。

Figure 1.Effects of BBR at different concentrations on the viabi-lity of MC3T3-E1 cells. Mean±SD.n=3.

图1不同浓度盐酸小檗碱对MC3T3-E1细胞活性的影响

2 盐酸小檗碱增加前成骨细胞ALP活性

MC3T3-E1细胞经不同浓度的盐酸小檗碱培养3 d后，5 mg/L BBR组的ALP活性明显高于对照组(P<0.01)；加药培养7 d，与对照组相比，不同浓度BBR组的ALP活性都有增加，其中5 mg/L BBR组的ALP活性最高，因此，后续实验中BBR组均采用5 mg/L这一浓度，见图2。

Figure 2.Effects of BBR at different concentrations on ALP activity in MC3T3-E1 cells. Mean±SD.n=3.*P<0.05，**P<0.01vs0 mg/L group at the same time.

图2不同浓度盐酸小檗碱对MC3T3-E1细胞ALP活性的影响

3 盐酸小檗碱促进MC3T3-E1细胞成骨分化相关因子的表达，其作用被LY249002抑制

与对照组相比，BBR处理显著提高MC3T3-E1细胞ALP、OCN、OPN和Runx2的mRNA表达(P均<0.01)；与BBR处理组相比，BBR+LY294002组与LY294002组的成骨分化相关因子的mRNA表达均明显减低(P<0.01)，见图3。

4 盐酸小檗碱促进MC3T3-E1细胞p-Akt蛋白的表达，其作用被LY249002抑制

Western blot分析显示，与对照组相比，BBR组p-Akt蛋白表达显著增加(P<0.01)，而BBR+LY294002组与LY294002组p-Akt的表达均明显降低(P<0.01),见图4。说明盐酸小檗碱能促进Akt磷酸化，激活PI3K/Akt信号通路，而LY294002能抑制盐酸小檗碱对PI3K/Akt信号通路的激活作用。

Figure 3.Effects of BBR and PI3K/Akt pathway inhibitor LY249002 (LY) on the mRNA expression of the molecules related to osteogenic differentiation in MC3T3-E1 cells. Mean±SD.n=3.**P<0.01vscontrol group;#P<0.05，##P<0.01vsBBR group.

图3盐酸小檗碱与PI3K/Akt信号通路抑制剂LY249002对MC3T3-E1细胞成骨分化相关因子mRNA表达的影响

5 盐酸小檗碱促进MC3T3-E1细胞的矿化，其作用被LY249002抑制

经矿化诱导培养基培养21 d，茜素红S染色后矿化结节呈红色。与对照组相比，BBR组钙结节形成明显；与BBR处理相比，BBR+LY294002组及抑制剂LY294002处理组细胞钙沉积面积明显减少。溶解矿化结节进行定量分析，检测数据表明，BBR组矿化结节溶解液的吸光度明显高于对照组；BBR+LY294002组及LY294002处理组矿化结节溶解液的吸光度明显低于BBR组(P<0.01)，见图5。这说明盐酸小檗碱能促进前成骨细胞的矿化，而LY294002能抑制盐酸小檗碱促进前成骨细胞的矿化作用。

Figure 4.Effects of BBR and PI3K/Akt pathway inhibitor LY249002(LY) on the expression of p-Akt protein associated with PI3K/Akt signaling pathway in MC3T3-E1 cells. Mean±SD.n=3.*P<0.01vscontrol group;##P<0.01vsBBR group.

图4盐酸小檗碱与PI3K/Akt信号通路抑制剂LY249002对MC3T3-E1细胞PI3K/Akt信号通路相关蛋白p-Akt表达的影响

Figure 5.Effects of BBR and PI3K/Akt pathway inhibitor LY249002(LY) on mineralization of MC3T3-E1 cells (alizarin red S staining, ×40). Mean±SD.n=3.**P<0.01vscontrol group;##P<0.01vsBBR group.

图5盐酸小檗碱与PI3K/Akt信号通路抑制剂LY249002对MC3T3-E1细胞矿化的影响

讨 论

骨质疏松症是全球范围内日益严重的公共健康问题，其防治与愈后也受到国内外学者的高度关注，然而，目前用于治疗骨质疏松的药物存在一定的副作用，以及疗效受其他药物影响，从而一定程度上限制其使用。因此寻求和研发安全，有效的抗骨质疏松药物是目前亟待解决的问题。

BBR是一种从中草药中分离出来的异喹啉类生物碱[14]，具有多种药理作用，包括抗菌[15]、抗肿瘤[16]、抗炎[17]、抗氧化及抗凋亡[18]等，最新研究发现BBR可在抗骨质疏松中发挥重要作用[19]。有研究表明BBR可通过介导p38 MAPK/Runx2信号通路直接促进骨髓间充质干细胞(mesenchymal stem cells, MSCs)的成骨分化[5]。另一项研究指出，BBR不仅可以通过增强Runx2的表达，还可以通过激活经典的Wnt/β-catenin信号通路来刺激MSCs的成骨分化[20]。在本研究中，我们发现BBR可能通过激活前成骨MC3T3-E1细胞中的PI3K/Akt信号通路，从而促进前成骨细胞的分化和钙化。为阐明BBR对前成骨细胞分化的调控作用，我们检测了不同浓度BBR对前成骨细胞碱性磷酸酶活性的影响，此外，本实验还对成骨细胞分化相关分子ALP、OCN、OPN和Runx2进行了研究。成骨细胞分化相关分子中, Runx2属于转录因子Runx家族成员，是成骨细胞分化和骨形成最关键的转录因子之一[21],它可以有效地启动主要骨基质蛋白基因的表达。

据报道,Runx2能够改善PI3K信号通路的活性,增加p85、p110β和Akt的蛋白表达，同时PI3K/Akt信号通路又可以改善Runx2和Runx2转录所依赖的DNA分子结合[22]，它们在成骨细胞分化调控中相互依赖。此外，Runx2可以通过与启动子结合，上调成骨基因OPN和OCN的表达来调控成骨细胞的分化[23]。成骨细胞分化过程分为2个阶段，在第一阶段，ALP的表达促进细胞分化，ALP是成骨细胞分化早期最常用的标志物之一，同时它也是一种重要的酶，能催化和上调成骨细胞分化基因OPN的表达[24]；在第二阶段，通过钙沉积而使基体矿化，在原始软骨周围形成一层海绵状的骨组织，然后海绵状骨充满骨基质，成为致密骨，从而增进骨的钙化使硬度增加[25]。因此，ALP活性作为早期分化标志物，OCN是成骨细胞分化的终末标志，代表成骨细胞的成熟和基质矿化过程。本研究发现，BBR有明显增强MC3T3-E1细胞ALP活性与增加MC3T3-E1细胞钙结节形成的作用，在药物浓度为5 mg/L时作用最为明显。Real-time PCR分析显示，BBR增加了ALP、OPN、OCN和RUNX2的mRNA表达。然而，PI3K/Akt抑制剂LY294002抑制了该药物的促进作用，表明BBR刺激MC3T3-E1成骨分化的能力可能通过PI3K/Akt信号通路参与调节。

PI3K/Akt信号通路在细胞增殖、分化、黏附和凋亡中起着重要作用[26]。Akt是PI3K/Akt信号通路的关键蛋白之一，作为PI3K下游关键的激酶，是细胞增殖、生长和存活的主要介导因子[27]。p-Akt作为Akt激活后的介导物质，通过激活PI3K/Akt信号通路下游的动物雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamycin,mTOR)，从而干扰细胞凋亡并促进增殖和运动[28]。PI3K/Akt信号通路在神经细胞以及心肌细胞缺血保护中起着重要作用[29]。此外，许多研究表明PI3K/Akt信号通路与骨组织代谢之间存在密切关系, 在成骨细胞中，活化PI3K/Akt信号通路能刺激细胞的增殖和分化，同时也能抑制细胞凋亡[30]。在治疗骨质疏松症的药物中，很多药物的作用通过对PI3K/Akt通路的调控来完成，如丹参素通过活化P13k/Akt通路减少骨质疏松大鼠中成骨细胞的凋亡[31]；淫羊藿苷通过调节PI3K/Akt通路对糖皮质激素引起的骨质疏松症具有一定的防治作用[6]。为了探究PI3K/Akt通路是否在BBR促进MC3T3-E1细胞分化和矿化过程中起着重要作用，我们在MC3T3-E1细胞干预中使用PI3K/Akt通路特异性抑制剂LY294002,Western blot结果表明与对照组相比，BBR组促进了MC3T3-E1细胞p-Akt蛋白的表达，而LY294002预处组p-Akt蛋白的表达明显下降。同样，LY294002预处理组，ALP、OCN、OPN和Runx-2的mRNA表达也有明显下降趋势，但BBR组的mRNA表达明显增加。这些结果表明PI3K/Akt通路可能在BBR对MC3T3-E1细胞的分化和钙化的调控中起着重要作用。

综上所述，BBR具有促进前成骨细胞分化和矿化的作用，其作用机制可能是通过激活PI3K/Akt信号通路来完成。因此，BBR有治疗骨质疏松症的潜能，为临床使用BBR治疗骨质疏松提供相应的实验依据，但该信号通路下游的调节机制尚有待进一步研究。