水稻谷蛋白基因GluC启动子的克隆及表达分析

李文静 孙艳香

(1.廊坊师范学院生命科学学院，廊坊 065000； 2.廊坊师范学院生命科学学院遗传与育种研究所，廊坊 065000)

胚乳是谷类作物淀粉和蛋白的储藏器官，为人类提供了丰富的能量和优质的蛋白，因此通过基因工程手段改良胚乳组分和品质具有重要意义[1]。不仅如此，相较于其他表达系统，以胚乳作为生物反应器具有产量高、生产成本低、易规模化、安全性高、远离动物病菌、绿色环保等优点[2～3]。然而目前仅有少数启动子能够驱动外源蛋白在胚乳中稳定高效表达[4]。谷蛋白占水稻种子贮藏蛋白的70%，主要在胚乳中表达。因此谷蛋白基因启动子是分离克隆强的胚乳特异性表达启动子的优质材料，对于控制外源基因在种子中特异表达具有重要理论和实践意义。

启动子在决定基因的时空特异性表达方面具有重要的作用，主要包括组成型启动子、组织特异性启动子和诱导型启动子三种类型[5]。近年来，一些强的组成型启动子，例如烟草花叶病毒35S(CaMV35S)启动子和玉米Ubiquitin启动子被广泛应用于植物基因工程领域[6～7]。但通常不能满足特定基因在特定组织的表达，而且目的基因持续高水平在所有组织中表达有可能对寄主植物造成伤害[8～9]。用强的胚乳特异性表达启动子驱动外源基因在水稻胚乳中特异表达，不仅可以实现目标蛋白的持续稳定表达，也可大大缓解由于大量异源蛋白在所有组织中的存在对植物造成的不可逆伤害[10～11]。目前已经从水稻、玉米、小麦等作物中分离克隆到一些胚乳特异性表达启动子[10,12～15]，但这些启动子在植物遗传系统中的应用尚少有报道[16]。农作物中许多重要性状，例如淀粉含量和次级代谢产物等都是受多基因控制，单个基因转化对此类性状改良效果甚微。近年来，同时构建几个基因到一个表达载体上的多基因转化系统逐步取代了传统的重复转化和杂交手段用以改良胚乳营养成分[17～19]。在这种多基因表达系统中，每一种基因都需要特异的启动子来驱动表达，以避免由于转入序列同源性过高而引起转基因沉默现象[20]。此外，启动子长度应该尽量缩短，避免长片段的断裂以及构建时无合适酶切位点的现象。因此分离并鉴定水稻胚乳特异性高表达的启动子是开展基因工程改良稻米品质的重要基础。前人研究多集中于启动子中顺式作用元件的类型、位置等对启动子的表达效率、表达模式产生的影响，而对胚乳特异性表达的启动子顺式作用元件的分析鲜有报道。

本研究以水稻品种kitaake为材料，克隆了GluC基因的启动子pGluC，分析其顺式作用元件，将一系列5′端缺失的启动子与GUS基因融合构建表达载体，转化水稻获得转基因株系。通过GUS组织化学染色和GUS活性分析明确水稻谷蛋白GluC基因启动子的表达模式和活性区域，为在水稻和其他谷类作物中实现多基因转化产生高附加值重组蛋白提供了理论依据。

1 材料与方法

1.1 实验材料

水稻(OryzasativaL.)为日本特早熟粳稻品种kitaake、植物表达载体pGPTV-GUS、大肠杆菌(E.coli)TOP10、根癌农杆菌菌株EHA105由廊坊师范学院遗传与育种研究所保存。

基因组DNA提取试剂盒(Aidlab)、限制性内切酶HindⅢ、SalⅠ和LA Taq均购自TaKaRa生物有限公司，质粒提取试剂盒及DNA凝胶回收试剂盒为Axygen公司产品。MS盐、6-苄氨基嘌呤(6-BA)、α-萘乙酸(NAA)、2,4-二氯苯氧乙酸(2,4-D)，利福平(Rif)抗生素、卡那(Kan)抗生素、羧苄青霉素、潮霉素等试剂，LB培养基、YEB培养基均购置于上海生工生物工程公司。

表1 本研究所用引物序列

注：下划线分别为HindⅢ(AAGCTT)和SalⅠ(GTCGAC)的酶切位点序列。

Note:The restriction enzymeHindⅢ(AAGCTT) andSalⅠ(GTCGAC) are indicated with underlines.

1.2 GluC启动子的克隆及序列分析

利用试剂盒提取水稻kitaake三叶期叶片基因组DNA，根据NCBI公布信息，应用DNAMAN软件设计上下游引物，采用常规PCR方法扩增GluC基因5′侧翼序列，PCR条件为：95℃ 5 min；94℃ 30 s，55℃ 30 s，72℃ 120 s，35个循环；72℃，10 min。扩增产物连接到pMD-18T载体上，转化到大肠杆菌TOP10，挑取单菌落经PCR鉴定后送至上海美吉生物工程公司测序。测序结果与已知序列比对后，利用启动子在线分析网站PlantCare(http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/plantcare/html/)[21]和PLACE(http://www.dna.affrc.go.jp/htdocs/PLACE/)[22]分析及预测启动子内部含有的顺式作用元件。

1.3 GluC启动子植物表达载体的构建

以全长GluC片段为模板，分别对功能元件所在的位置进行5′端缺失，分别设计GluC-F1、GluC-F2、GluC-F3、GluC-F4、GluC-F5、GluC-F6、GluC-F7七个正向引物和GluC-R配对，进行PCR扩增。F、R引物上分别带有HindⅢ和SalⅠ酶切位点，PCR扩增获得1 911、1 611、1 311、999、451、203、102 bp七个片段。将PCR片段通过TA克隆插入到pMD18-T载体中，分别命名为P1、P2、P3、P4、P5、P6、P7。HindⅢ和SalⅠ对以上载体进行双酶切鉴定，酶切验证正确的质粒送去测序。将测序正确的T载体以及pGPTV-GUS载体分别用HindⅢ和SalⅠ双酶切，回收酶切片段，连接，转化大肠杆菌TOP10，得到的阳性克隆分别命名为P1-GUS、P2-GUS、P3-GUS、P4-GUS、P5-GUS、P6-GUS、P7-GUS(图1)。

图1 pGluC-deletion载体构建示意图Fig.1 Schematic diagram of the expression vector pGluC-deletion construction

1.4 水稻的遗传转化及阳性植株检测

热激法将重组植物表达载体导入农杆菌EHA105中，水稻愈伤组织培养于光照培养箱，通过农杆菌介导的遗传转化方法转化水稻胚性愈伤组织。农杆菌和水稻愈伤在28℃共培养3 d，侵染的愈伤在含有45 mg·L-1潮霉素的N6D筛选培养基上培养5～6周、转移至MS分化培养基上，获得T0代转基因水稻。提取含8种不同类型启动子的转基因水稻植株(以非转基因水稻为对照)的叶片基因组DNA，以其为模板，植物表达载体pGPTV-GUS上的GUS基因为目标基因设计引物(GUS-F，GUS-R)进行PCR扩增，产物大小为472 bp，经10 g·L-1琼脂糖凝胶电泳检测。

1.5 GUS基因的半定量RT-PCR分析

提取转pGluC启动子转基因水稻的根、茎、叶及灌浆期种子总RNA，经DNaseI消化，用逆转录酶(M-MLV)反转录成cDNA，以水稻Actin基因为内参，RT-PCR方法检测GUS基因的表达情况。

1.6 转基因植株的GUS组织化学分析

分别取非转基因水稻、转P1-GUS、P2-GUS、P3-GUS、P4-GUS、P5-GUS、P6-GUS、P7-GUS载体的阳性植株和pGluC启动子阳性植株，成熟期后分别取根、茎、叶和种子进行GUS染色，具体步骤参照Jefferson等[23]方法进行。将待染色的根、茎、叶材料，剪成0.5 mm的小段，开花后17天的种子纵切成两半，放入1.5 mL离心管中。每管加入适量X-GluC(50 mmol·L-1磷酸钠缓冲液(pH7.0)，20%甲醇，5% DMF，0.5 mg·mL-1X-GluC)反应液，37℃染色2 h或者过夜，除去染液。用70%酒精脱色3次，至阴性对照材料呈白色，体视镜扫描照像。

1.7 GUS活性测定分析

GUS活性的荧光检测方法参照Jefferson[23]。取茎、叶及转基因水稻开花后17天(17 DAF)水稻种子，分别放于1.5 mL离心管中，在200 μL GUS提取液(50 mmol·L-1NaHPO4(pH7.0)，10 mmol·L-12-Me，10 mmol·L-1Na2-EDTA，0.1% SDS，0.1% Triton X-100)中研磨匀浆。12 000 r·min-1离心10分钟，上清液即为GUS粗蛋白提取液。以4-MU配制标准曲线，4-MUG作为底物进行酶促反应，反应产物在激发光365 nm，发射光455 nm，狭缝10 nm条件下测定各样品的荧光值，Bradford法进行GUS蛋白定量。

2 结果与分析

2.1 pGluC在胚乳中的特异性表达

以水稻kitaake基因组DNA为模板，GluC-F、GluC-R为引物进行PCR扩增，得到2 332 bp的GluC启动子片段(图2A)，命名为pGluC。将扩增片段及植物表达载体pGPTV-GUS分别用HindⅢ和SalⅠ双酶切后连接，经酶切检测和测序验证获得正确的重组载体pGluC-GUS。通过农杆菌介导法转化水稻愈伤组织，获得转基因植株(图2B)。RT-PCR分析和GUS组织化学染色显示pGluC-GUS在水稻根、茎、叶中始终检测不到表达，仅在水稻种子胚乳中表达(图2C)，结果表明pGluC为胚乳特异性表达启动子。

2.2 GluC启动子顺式作用元件分析及功能预测

通过启动子顺式作用元件分析网站PlantCare(http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/plantcare/html/)和PLACE(http://www.dna.affrc.go.jp/htdocs/PLACE/)分析启动子pGluC内包含的顺式作用元件。结果显示-2331～+1片段是GluC基因的5′端序列，TATA box位于-68～-62(起始密码子为+1)。全长pGluC启动子内部含有多种启动子表达所必需的顺式作用元件(图3，表2)，除基本的调控元件TATA-box和CAAT-box外，还包含多个胚乳特异性表达元件，如Skn-1 motif和ACGT motif，与2.1结果pGluC是一个胚乳特异性启动子相符合。

图2 pGluC转基因植株获得及表达模式分析 A.水稻GluC启动子pGluC的克隆；B.转基因植株获得；C.pGluC组织表达模式分析Fig.2 Production of pGluC transgenic plants and analysis of the expression pattern A.Amplified fragment of GluC gene pGluC in rice; B.Production of transgenic rice plants; C.Expression pattern of the pGluC promoter

元件Element序列及数量Sequence and number位置Location(bp)功能FunctionA-boxCCGTCC,1-2089～-2084顺式调控元件cis-acting regulatory elementACGT-boxACGT,3-1878～-1875,-534～-531,-427～-424胚乳特异表达所需的顺式作用元件cis-acting regulatory element required for endosperm expressionARETGGTTT,1-1744～-1739厌氧诱导必须顺式作用元件cis-acting regulatory element essential for the anaerobic inductionCAAT-boxCAAT,15-2120～-2177,-1995～-1991,-1788～-1784,-1673～-1670,-1473～-1468,-1395～-1392,-1263～-1259,-1061～-1057,-941～-937,-787～-783,-659～-655,-546～-543,-455～-452,-423～-419,-234～-231启动子和增强子内部通用顺式作用元件Common cis-acting element in promoter and enhancer regionsCATT-motifGCATTC,1-341～336部分光响应元件Part of a light responsive elementCiradianCAATGGTATC,1-269～-260生物节律调控cis-acting regulatory element involved in circadian controlI-boxATCTTATGCT,1-518～-519部分光响应元件Part of a light responsive elementMBSCAACTG,1-1697～-1692与干旱诱导相关的MYB结合位点MYB binding site involved in drought-inducibilityMREAACCTAA,1-639～-633与光反应相关的MYB结合位点MYB binding site involved in light responsivenessSkn-1 motifGTCAT,3-1335～-1331,-562～-558,-445～-441胚乳特异表达所需的顺式作用元件cis-acting regulatory element required for endosperm expressionTATA-boxTATATAA,1-68～-62核心启动子元件Core promoter element

注：GluC的起始密码子ATG中A位置标记为+1，第三列代表距离起始密码子ATG上游的位置，用负号(-)标记。

Note:Location(bp) of A in the GluC initiation codon ATG is marked +1,and the third column indicates location relative to upstream of GluC initiation codon ATG,denoted with minus(-).

图3 启动子pGluC序列及预测的顺式作用元件 启动子不同元件被标注，元件名称在标记上方给出。箭头代表启动子序列被截短的位置。Fig.3 Sequence and predicted cis-acting elements of pGluC Various elements of the promoter are shaded and their names are given on the top. The sites where the promoter sequence were shortened are marked by arrows.

2.3 缺失载体构建及水稻遗传转化

基于对启动子pGluC的生物信息学分析结果，结合已知顺式作用元件在启动子内的分布和功能预测，转录起始位点上游-1 911、-1 611、-1 311、-999、-451、-203、-102 bp七个区域作为候选启动子，构建了7种5′端缺失载体。以pGluC-GUS重组质粒为模板，通过设计对应引物进行PCR扩增。将这7个扩增产物通过TA克隆插入到pMD 18-T载体中，分别命名为P1、P2、P3、P4、P5、P6、P7。对以上T载体进行双酶切鉴定(图4A)，酶切验证正确的质粒送去测序。将测序正确的T载体以及pGPTV-GUS载体双酶切后进行连接，转化大肠杆菌TOP10，提取质粒双酶切验证获得正确的重组质粒(图4B)。将这些阳性克隆分别命名为P1-GUS、P2-GUS、P3-GUS、P4-GUS、P5-GUS、P6-GUS、P7-GUS。重组质粒通过农杆菌介导法转化水稻，获得转基因植株。对转基因植株进行潮霉素筛选，之后使用GUS-F和GUS-R引物进行PCR扩增，呈阳性的T0代单株(图5)，用于后续实验。

图4 启动子5′端缺失T载体和 重组载体的酶切鉴定 A：M. DL5000 Marker; 1. P1/HindⅢ+SalⅠ; 2. P2/HindⅢ+SalⅠ; 3. P3/HindⅢ+SalⅠ; 4. P4/HindⅢ+SalⅠ; 5. P5/HindⅢ+SalⅠ; 6. P6/HindⅢ+SalⅠ; 7. P7/HindⅢ+SalⅠ B：M. DL5000 Marker; 1. P1-GUS/HindⅢ+SalⅠ; 2. P2-GUS/HindⅢ+SalⅠ; 3. P3-GUS/HindⅢ+SalⅠ; 4. P4-GUS/HindⅢ+SalⅠ; 5. P5-GUS/HindⅢ+SalⅠ; 6. P6-GUS/HindⅢ+SalⅠ; 7. P7-GUS/HindⅢ+SalⅠFig.4 T and recombinant vector identification of 5′ deletion of promoter fragements

图5 T0代转基因水稻的PCR检测 M. DL5000 Marker；1.阳性对照；2.阴性对照，非转基因水稻；3～12.不同转基因的水稻植株Fig.5 PCR analysis of T0 transgenic rice plants M. DL5000 Marker; 1. CK+; 2. CK-,non-transformed rice; 3-12. Different transgenic rice plants

图6 截短的pGluC启动子GUS表达模式分析 a.根；b.茎；c.叶；d.种子Fig.6 The GUS staining results on the transformants of deleted pGluC promoter a.Root; b.Stem; c.Leaf; d.Seed

2.4 不同启动子组织表达特异性分析

为了检测GluC启动子的时空表达特异性，分别取非转基因水稻和T0代转基因植株的根、茎、叶、种子进行GUS组织化学染色。结果显示非转基因水稻(kitaake)的根、茎、叶、种子无任何蓝色斑点出现。pGluC启动子驱动GUS在水稻种子胚乳中有很强的表达，在根、茎、叶片中不表达。P1-GUS，P2-GUS，P3-GUS与pGluC-GUS表达模式一致，仅在水稻种子胚乳中表达。而P4-GUS，P5-GUS，P6-GUS，P7-GUS除在胚乳中表达外，根、茎、叶等营养器官中GUS染色也呈蓝色。P4-GUS与P5-GUS在茎、叶子中GUS有了不同程度表达。P6-GUS与P7-GUS在转基因水稻植株根、茎、叶中均有表达。但P7-GUS在各个部位表达强度均较弱，且种子中表达水平明显降低(图6)。结果表明，GluC启动子内部可能含有一些控制pGluC在特定组织中表达的功能性顺式作用元件。

2.5 pGluC及截短的启动子的GUS活性分析

转基因植株经GUS组织化学染色分析后，初步判断不同长度启动子驱动的GUS基因的表达模式，但并不能判断启动子活性大小。为了进一步明确启动子的活性，对携带启动子缺失片段的转基因植株进行GUS活性分析。每个载体测定十个植株，其GUS酶活性是10株植株的平均值。

提取8个载体茎、叶、种子的蛋白，以4-MUG为底物，进行GUS活性的荧光检测。P1-GUS，P2-GUS，P3-GUS与pGluC-GUS表达模式一致，根、茎、叶中检测不到GUS信号，而种子中有很强的GUS表达。当启动子缺失至-999 bp时，茎、叶中也有表达，种子中表达强度与全长启动子基本没有区别。从-999 bp缺失至-451 bp时，种子中表达略微下降，茎中与前者相比表达水平升高，叶中与前者相比表达水平降低。从-451 bp缺失至-203 bp时，种子中GUS表达强度明显降低，后者仅是前者的20%；茎、叶中表达量增加，均是前者的3.5倍；从-203 bp缺失至-102 bp时，种子中表达强度进一步下降，后者表达量仅是前者的6%；叶中表达量也明显下降，后者仅是前者的22.2%；茎中则增加，后者是前者的1.39倍(图7)。以上结果表明-1 311 bp GluC启动子，能够驱动GUS基因在水稻种子胚乳中高效特异稳定表达。-1311～-999 bp区间可能含有抑制茎和叶中表达的顺式作用元件，-999～-451 bp区间可能含有促进种子和叶子中表达，抑制茎中表达的顺式作用元件，-451～-203 bp区间可能含有促进茎叶以及抑制种子表达的顺式作用元件，-203～-102 bp区间可能含有促进种子、叶子以及抑制茎中特异表达的顺式作用元件，ATG上游-999 bp以内区间的ACGT-box和Skn-1 motif具有增强胚乳特异性表达的作用。

图7 转基因水稻GUS定量分析Fig.7 Quantification of GUS activity in transgenic rice

3 讨论

高等植物基因表达受转录水平、转录后水平和翻译水平多方面的调控，外源基因在受体内的表达受到拷贝数、插入位置、启动子类型等诸多因素的影响，但很大程度上依赖于驱动外源基因表达的启动子[24]。启动子在很大程度上决定了基因的表达部位、表达时期和表达水平。目前，研究启动子主要通过生物信息学分析和实验分析两种方式进行。生物信息学方法分析启动子序列，可以预测其中的顺式作用元件种类、数目及位置，为进一步研究启动子的功能奠定基础。实验分析主要通过瞬时表达、酵母单杂交[25]、凝胶阻滞[26]和5′端片段缺失分析[27～28]等方法中的一种或几种混合进行。本研究采用生物信息学分析和不同长度启动子融合GUS基因稳定表达相结合的方法，研究GluC基因启动子的重要顺式作用元件和表达特性。

报告基因在分析启动子的组织表达特异性方面具有重要作用，在众多报告基因中，GUS基因由于其敏感性和简单易操作性被广泛应用。相较于瞬时转化分析，我们采用农杆菌介导的稳定转化方式来解析GluC启动子的功能。尽管使用基因枪介导的瞬时转化方法进行特定植物组织的转化可以验证某些胚乳特异性表达启动子的活性[29～30]，但是这些组织特异性启动子的瞬时表达并不能正确反映其稳定转化的表达模式[31]。有关胚乳组织的瞬时表达研究可以辅助寻找一段启动子序列，但是对于内源基因在胚乳内的表达模式或发育时期的研究鲜有报道[32]。此外，研究表明稳定转化对于种子特异性表达启动子的正确调控是必须的[33]。因此，将GUS报告基因与GluC启动子融合通过遗传转化获得转基因植株来研究GluC启动子的功能更行之有效。

本研究选取转基因植株的根、茎、叶、种子进行GUS组织化学染色和GUS定量分析。前人研究表明，2.3 kBGluC启动子驱动GUS在开花后7 d水稻胚乳糊粉层、亚糊粉层表达，随着开花时间延长，17 d时在整个水稻胚乳表达[13]。因此我们也选取转基因植株开花后17 d种子作为材料。结果表明，GluC启动子驱动GUS在胚乳中高表达，而根、茎、叶中检测不到GUS信号(图2C)。启动子在线分析表明该启动子除了具有核心顺式作用元件CAAT-box和TATA-box外，还含有胚乳特异性表达所必需的ACGT-box和Skn-1 motif。这与GluA-1，GluA-2，GluA-3，GluB-3，GluB-5等谷蛋白基因启动子通过其内部含有的保守的GCN4和AACA元件来介导胚乳特异性表达有所不同[13,34]，说明GluC启动子可能通过新的调控方式介导胚乳特异性表达。

为了研究胚乳特异性表达顺式作用元件的功能，我们对GluC启动子进行了5′端缺失分析。我们构建了7个缺失启动子载体，分别转化水稻，通过潮霉素抗性筛选及基因组PCR扩增，获得转化不同长度启动子片段的阳性植株。结果表明，P1-GUS，P2-GUS，P3-GUS与pGluC-GUS表达模式一致，稳定的GUS信号仅在水稻种子的胚乳中出现，而根、茎、叶中均检测不到GUS表达(图6～7)。当启动子缺失至-999 bp时，茎、叶中开始出现表达；进一步缺失至-343 bp时，茎、叶、根中GUS均出现不同程度表达(图6～7)。这与ZmDULL1胚乳特异性表达启动子渐进缺失后，-343～-1 bp区间介导的GUS活性与全长启动子一致，当片段延长到-1 216或-1 676 bp时，启动子活性反而降低，但是仍能介导胚乳特异性表达结果不同[35]。说明GluC启动子内部含有促进或者抑制根、茎叶中表达的顺式作用元件，以复杂的调控方式介导胚乳特异性表达。因此继续探明GluC启动子内部促进或抑制根茎叶中表达的顺式作用元件，将有助于精准揭示其调控机制。

综上所述，GluC启动子内部含有胚乳特异性表达元件，驱动GUS基因在胚乳中稳定高效表达。1 311 bpGluC启动子内部含有两个Skn-1 motif和两个ACGT-box以及TATAbox(图3，表2)，足以驱动胚乳特异性高表达。在植物基因工程中，1 311 bpGluC启动子可以替代2.3 kBGluC启动子，更好地被应用。此外，我们可以分离出胚乳特异性表达元件，人工组建启动子，应用于分子育种，提高重组蛋白在水稻种子生物反应器中的含量。

4 结论

从水稻品种kitaake基因组DNA中克隆了GluC基因的启动子pGluC，长度为2 322 bp，该启动子内部含有胚乳特异性表达元件ACGT-box和Skn-1 motif，驱动GUS基因特异地在水稻种子胚乳中表达，根、茎、叶中未检测到表达。1 911、1 611、1 311 bpGluC启动子组织化学表达模式以及表达活性与全长启动子一致，仅在水稻种子胚乳中表达。在植物基因工程中1 311 bpGluC启动子操作方便，可以起到替代全长GluC启动子的作用。本研究结果为组织特异性表达启动子的开发和应用提供了依据。