真菌诱导子对茶条槭细胞没食子酸积累的影响

齐凤慧 陈思齐 景天忠 张宇昕 詹亚光*

(1.东北林业大学生命科学学院，哈尔滨 150040； 2.东北林业大学林木遗传育种国家重点实验室，哈尔滨 150040； 3.东北林业大学林学院，哈尔滨 150040)

没食子酸(Gallic acid,GA)，即3，4，5-三羟基苯甲酸，又称倍酸、五倍子酸，是在植物中发现的游离或酯化形式的主要内源性酚酸之一。没食子酸是一种重要的生物活性物质。早在1983年，刘国卿等从野葡萄中分离获得没食子酸，药理研究表明，没食子酸对蛋清，5-羟色胺、甲醛引起的大鼠足跖肿胀有良好的抗炎作用，对金黄色葡萄球菌有较强的抑制作用。随着科学技术的发展，对没食子酸的生物活性研究更加广泛。除了抗菌活性外，GA还具有抗氧化活性[1]，能快速、有效的清除DPPH(2,2-Diphenyl-1-picrylhydrazyl)自由基、过氧化氢和羟自由基，抑制脂质过氧化反应[2]。GA对多种肿瘤有抑制作用[3]，并能直接杀伤肿瘤细胞。如黑色素瘤细胞[4]、胶质瘤细胞[5]、肺癌[6]、白血病[7]等。近年来的研究还表明GA能通过Ca2+/calpain I介导的坏死级联反应引起选择性HSC(hepatic stellate cells)细胞的死亡，表明其可用于治疗肝脏纤维化[8]。

GA在轻工、染料、制药等领域也有广泛应用。以GA为原料，采用分段蒸馏、分层冷凝收集的方法[9]或通过微生物降解没食子酸生产焦性没食子酸[10]。没食子酸还可以用来制造多种燃料、焰火稳定剂、蓝黑墨水等，也是紫外线吸收剂、阻燃剂，半导体光致抗蚀原料，可配制防锈底漆和铝合金有机涂层，配制水基钻探泥浆用流化剂，其效果可与木质素磺酸盐相媲美，甚至更好[11]。

GA在植物中主要以酚酸类物质的形式存在[12]，而游离的成份非常低。所以工业生产GA的方法主要是用酸、碱或单宁酶水解单宁[13～14]，而单宁则来自于富含单宁的植物，如茶条槭[15]、塔拉[14]等。这类生产方法需要大量的原材料，容易导致对原材料植物的掠夺式开发，破坏生态环境。此外，这类生产方法，特别是采用酸、碱水解的方法，往往对环境的污染也很大。因此，利用生物技术开辟了另一种途径，即细胞培养来生产这些化合物。用细胞培养可以连续生产植物产品，而不受季节或环境的影响[16～17]。

目前已经建立了通过愈伤组织繁殖茶条槭细胞生产没食子酸的方法[18]。同时还建立了悬浮细胞培养系统，并对GA的生产进行了优化[19]。然而，和其他植物次生代谢产物一样，GA合成通常在植物细胞培养中被抑制[20]。而真菌诱导子广泛应用于植物细胞次生代谢产物合成中，植物细胞与真菌的相互作用中通过信号传导途径，引起植物基因表达发生变化，从而调节植物次生代谢产物合成途径中相关酶的活性，最终刺激植物发生防御反应，诱导特定次生代谢产物的生成和积累，从而提高次生代谢产物的产量。因此，本文通过添加真菌诱导子促进合成没食子酸，并对诱导过程中细胞的生长状况进行检测，为茶条槭细胞生产没食子酸研究和利用提供一定的理论依据和技术支持。

1 材料与方法

1.1 茶条槭悬浮细胞的培养

细胞采用3倍大量元素的WPM培养基，摇床转速为120 r·min-1，培养温度为(24±1)℃，暗培养。每隔约15天继代1次，实验前，将培养了3～4代以上长势良好的细胞，分装到含50 mL新鲜液体培养基的250 mL椎形瓶中，接入约4 g鲜重的细胞进行培养，用于实验研究。

1.2 内生真菌诱导子的制备

选择Phomopsissp.内生真菌，用打孔器(直径1 cm)取1个菌饼接种于含有PDA液体培养基的250 mL椎形瓶中，28℃，110 r·min-1摇床上，培养7 d收获菌丝。

采用直接酸解法：取10 g菌丝研磨后，加入1 L酸化蒸馏水(pH=2)中并保持沸腾1 h。加压抽滤，取滤液，定容为1 L，用NaOH调pH为5.0，冷冻保存，使用时用0.22 μmol·L-1滤膜过滤灭菌，每个培养瓶中添加2.5 mL，相当于真菌多糖98 mg·L-1[21]。

1.3 内生真菌诱导子添加浓度的选择

在细胞培养当天加入0、1、2、2.5、3、4 mL的真菌诱导子，培养5 h后检测PAL酶活性和没食子酸含量。

1.4 细胞形态观察

PI-Hoechst 33342双重染色及荧光显微镜观察：参照Ormerod等人的方法[22]，荧光染料Hoechst 33342与PI购自Sigma公司，分别用双蒸水配制成10和50 μg·mL-1的浓度，4℃保存待用。取悬浮培养的细胞0.5 mL，3 000 r·min-1离心10 min，弃去培养液，用pH5.8的PBS冲洗3次，同时用吸管将细胞吹打均匀，防止细胞聚集成团。在200 μL的细胞悬液中同时加入各20 μL的Hoechst 33342和PI，室温下放置15 min，取适量细胞悬液涂片，以380 nm为激发波长，以400 nm为发散波长，激光共聚焦扫描拍照。

1.5 细胞内钙离子浓度的检测

荧光探针导入：探针均购自sigma公司，用DMSO配制成1 mmol·L-1的贮液。取悬浮细胞至1.5 mL离心管中，3 000 r·min-1，10 min后弃上清，加入200 μL WPM培养基(与茶条槭悬浮细胞液体培养基成分相同)和5 μL探针至终浓度为25 μmol·L-1(加入探针后均要避光进行后续实验)小心混匀，冰上放置，置于摇床上振荡2 h。离心弃上清，用培养基洗2次除去多余的探针，室温放置1 h后涂片观察。

激光扫描共聚焦扫描荧光：CLSM的工作条件为：Ex=488 nm，在λ mode选择起始、终止波长分别为516.1和601.7 nm。output 60%，Frame 1024×1024，speed=6，mean=4，Z轴扫描。每10秒检测一次图像和荧光数据，总时间为10 min。为确保不同实验之间具有一定的可比性，所有的荧光图像都在相同的设置下获得(即通过人工将仪器中相关参数如Iris，Gain，Offset，Power等设置为固定值)。

1.6 培养液电导率和pH的测定

采用精密酸度计(上海雷磁仪表厂)和电导率仪(型号：DDS-22C)测定。

1.7 没食子酸含量检测

没食子酸对照品购自中国药品生物制品检定所。使用Waters液相色谱系统(包括600泵、717自动进样器、2487检测器、2996检测器、柱温箱等)，C18色谱柱4.6 mm×250 mm，5 μm，流动相为甲醇∶水=4∶6，流速为0.5 mL·min-1，检测波长：270 nm；进样量为10 μL；柱温为25℃。标准品配置：精确称取没食子酸标准品0.005 0 g，置于50 mL容量瓶中，加甲醇溶解并定容至刻度，摇匀。配制成0.1 mg·mL-1的标准液。

样品处理：精密称定经100目细胞筛筛过的茶条槭悬浮培养细胞干粉末0.100 g，精密加入2.0 mL 10%浓硫酸，2.0 mL甲醇，超声2 min，加入甲醇定溶至5 mL，60℃水浴1 h，0.45 μm滤膜过滤，超声10 s，进样[23]。

1.8 PAL酶活测定

PAL酶提取液配制：100 mL 0.2 mol·L-1磷酸盐缓冲液(pH7.2)，加入1 g PVP(聚乙烯基吡咯烷酮)。使用前现加入15 μL巯基乙醇和5 μL的100 mmol·L-1的PMSF(苯甲基磺酰氟)。

PAL粗酶液提取：取pH7.2磷酸盐缓冲液悬浮洗涤细胞，抽滤。加液氮研磨成粉，称取粉末0.2 g，放于1.5 mL的离心管，加入提取液0.6 mL，振荡混匀，以上操作均在冰上进行。4℃ 8 000 g，离心30 min。上清转移至新1.5 min离心管，立即进行酶活测定。以每小时吸光值增0.1为一个酶活单位(U)，即A290/Δt=0.1/1 h为1 U[24]。

1.9 数据处理

数据图(直方图、折线图)和方差分析均采用SPSS15.0软件。在显著性分析时，α′值取0.1。

2 结果

2.1 真菌诱导子添加浓度的选择

苯丙氨酸解氨酶(PAL)是催化苯丙烷类代谢途径第一步反应的关键酶和限速酶，因此调节这些酶的表达活性，可有效地调节与之相应的次级代谢产物的生物合成。本文在细胞培养当天加入0、1、2、2.5、3、4 mL的真菌诱导子，培养5 h后检测PAL酶活性和没食子酸含量，结果(图1～2)表明浓度为2.5 mL时PAL酶活性和GA含量最高。因此选用填加2.5 mL真菌诱导子为后续实验诱导浓度。

图1 不同浓度真菌诱导子诱导细胞内PAL活性Fig.1 Activity of PAL of the plant cell after induced by the fungal elicitor with different concentration

2.2 真菌诱导子诱导茶条槭细胞没食子酸含量的改变

在细胞培养14 d时添加真菌诱导子结果如图3所示，诱导组中没食子酸含量在24 h前呈平缓状态，诱导24 h后开始快速升高，并在48 h达到最高点，之后又降低。说明在24 h前细胞生长和相关酶类活性的增加，为细胞后期产生没食子酸提供了可能性，使没食子酸逐渐积累在48 h达到高峰，其含量为12.2 mg﹒g-1DW，是对照组的1.58倍左右。方差分析表明，细胞诱导培养24 h后，差异达到极显著(F=41.134，P=0.003)。表明真菌诱导子(拟茎点霉属Phomopsissp.)对茶条槭细胞中没食子酸合成是有促进作用的。

图2 不同浓度真菌诱导子诱导细胞内没食子酸含量Fig.2 Gallic acid content of the plant cell after induced by the fungal elicitor with different concentration

图3 真菌诱导子诱导茶条槭细胞没食子酸含量的积累Fig.3 Gallic acid content of the cell after induced by the fungal elicitor

图4 真菌诱导子作用后细胞膜透性变化 A1,B1,C1.用Hoechst33342染色；A2,B2,C2.用PI染色；A3,B3,C3.是PI-Hoechst33342结合Fig.4 Membrane permeability of the cell after induced by the fungal elicitor A1,B1,C1.Nuclear dyed with hoechst 33342; A2,B2,C2.Nuclear dyed with PI; A3,B3,C3.Combination of a,b and c

2.3 真菌诱导子诱导茶条槭细胞膜通透性的改变

本文选用Hoechst 33342和propidium-iodide(PI)双染的方法对诱导子作用下的细胞核形态进行了观察(图4)。PI、Hoechst 33342均可与细胞核DNA(或RNA)结合。但是PI不能通过正常的细胞膜，Hoechst则为膜通透性的荧光染料，故正常细胞均可被Hoechst着色，呈圆形，淡兰色，内有较深的兰色颗粒，细胞膜通透性增大时细胞核可被PI染成红色。通过PI-Hoechst 33342双重染色及激光共聚焦显微镜观察发现，在没有加真菌诱导子的细胞中，细胞膜的通透性良好，PI染料没有通过细胞膜，细胞核只呈蓝色(图4:A1)，而无红色(图4:A2)；在细胞被诱导5 h时，部分细胞的细胞膜通透性增大，细胞核被PI染料染成红色(图4:B2)，PI染色后的细胞核与Hoechst 33342染色后的细胞核完全重合(图4:B3)；随着诱导时间的增加，在细胞被诱导24 h时，通过PI-Hoechst 33342双染发现细胞核被染成蓝色和红色，这说明真菌诱导子可使茶条槭细胞膜的通透性增大。同时还观察到在一个细胞中出现两个细胞核(图4:C1～3)。说明真菌诱导子有可能促进了核内有丝分裂。

2.4 真菌诱导子诱导茶条槭细胞培养液的pH值和电导率变化

在茶条槭细胞悬浮培养14 d时，加入真菌诱导子后，细胞培养液pH值与对照相比发生了变化，呈降升交替变化趋势，其中在诱导5 h时，pH值由诱导起始时的6.79升高到7.08，之后迅速降低，在24 h时又达到另一个高峰，但此时的pH值低于起始时的pH值。而对照组开始基本不变，在5 h时开始降低，在10～48 h内基本没有改变(图5)。方差分析表明，这种差异不显著(F=1.295，P=0.274)。电导率反映了无机盐离子的吸收利用的情况。本研究中，培养液中电导率如图6所示：在真菌诱导子作用下，培养液中电导率逐渐降低，在48 h时达到低谷，之后开始上升。而对照组电导率一直呈上升趋势。方差分析表明，这种差异显著(F=9.382，P=0.008)。这一结果说明真菌诱导子可能促进了细胞对培养液中的无机盐离子的吸收，以满足细胞快速生长的需要。

图5 加入真菌诱导子后茶条槭细胞培养液pH的变化Fig.5 The pH of the culture media after the fungal elicitor was added

图6 真菌诱导子诱导茶条槭细胞培养液的电导率的改变Fig.6 Electric conductivity of the culture media after the fungal elicitor was added

2.5 真菌诱导子诱导茶条槭细胞PAL酶的活性变化

PAL是催化苯丙烷类代谢途径第一步反应的关键酶和限速酶，本研究中(图7)在真菌诱导子作用下，细胞PAL酶活性升高，但并不是一直上升，而是有升有降，在诱导3、10和48 h时达到高峰，其中在10和48 h时强度分别是对照的1.16和1.75倍左右。方差分析表明，这种差异达到显著水平(F=4.404，P=0.054)。说明是细胞对外界刺激后产生快速应答的反应，真菌诱导子可使细胞内PAL酶活性在短时间内升高；而随着细胞内次生产物的合成，消耗一部分PAL酶，而导致PAL活性降低，之后再积累升高，消耗降低，这样循环往复，促使次生代谢产物的积累。

图7 真菌诱导子对PAL酶活性的影响Fig.7 PAL activity of the suspension cells after the fungal elicitor was added

2.6 真菌诱导子对茶条槭细胞质内Ca2+浓度的影响

细胞培养24 h后加入Fluo-3/AM钙离子荧光探针，在激光扫描共聚焦显微镜下观察，发现真菌诱导子诱导的悬浮细胞内只有微弱的荧光(图8)，这说明真菌诱导子在诱导细胞内没食子酸合成时，Ca2+浓度没有明显增加。这一结果可能是由于诱导子的起源，并且植物可能对内生菌和病原体显著反应。Lecourieux等人也报道了类似的结果，在用寡聚半乳糖醛酸苷和昆布多糖诱导的烟草细胞中没有检测到Ca2+浓度的增加[25～26]。

图8 真菌诱导子作用后茶条槭细胞内Ca2+浓度的变化红、黄、绿、蓝颜色表示荧光强度依次降低Fig.8 Calcium influx of the plant cell after induced by the fungal elicitor Red,yellow,green and blue indicate descending fluorescence intensity

3 讨论

已有研究表明，添加真菌诱导子能够促进植物细胞次生代谢产物的积累，李家儒等[27]在细胞生长第20天，每100 mL培养液加入2 mL桔青霉诱导子，可使胞内的紫杉醇含量达199.1 μg·g-1DW。徐志荣等[28]在细胞悬浮培养第8天加入100 μg·mL-1真菌诱导子，可明显增加悬浮细胞的生物量，紫杉醇的含量也有提高。研究表明对细胞具有诱导活性成分的主要是真菌诱导子中的多糖物质[29]。真菌诱导子通常包含寡糖，肽和脂质，这些物质均可以被植物细胞膜相应的位点所识别，从而改变细胞膜的特性，而植物细胞膜上的质子泵活性是钙离子通道的动力来源。细胞培养液pH值增加意味着培养液中的质子浓度下降，为了保持细胞内外的离子浓度平衡，必然有阳离子由胞内流向胞外，从而引发一系列的生物学效应。而本研究中，真菌诱导子在添加后48 h时使没食子酸含量达到最高为12.2 mg·g-1DW，茶条槭细胞膜的通透性增大，但培养基中的pH值并没有明显变化，诱导后的细胞也未观察到钙离子流入。培养液中的无机成分和矿物质营养素的消耗会导致电导率的下降[30]。本研究中电导率在诱导组和对照组中均逐渐下降，统计分析表明真菌诱导子对电导率下降有显著影响，这表明细胞在真菌诱导子诱导后可能消耗更多的矿物质营养来进行次生代谢产物的合成[30]。苯丙氨酸解氨酶(PAL)是连接初生代谢和次生代谢的关键酶，PAL的活性与细胞的分化密切相关。我们发现真菌诱导子促进没食子酸在茶条槭细胞中积累的同时，也促使了细胞中PAL活性显著升高，由此推测PAL酶可能参与了真菌诱导没食子酸的合成。

综上所述，真菌诱导子能够专一、快速的诱导植物细胞中特定基因的表达，从而使次生代谢途径中关键酶活性增强、使目的次生代谢产物含量增加。因此，本研究分析了真菌诱导子对茶条槭细胞膜通透性及PAL酶活性的影响等，明确了真菌诱导子提高茶条槭细胞中没食子酸含量的同时，细胞及培养基中一些生理特征的变化情况，为进一步研究真菌诱导子诱导机制奠定基础。