产单宁酶海洋短梗霉的分离筛选及酶学性质的研究

赵春海

(滨州职业学院,山东 滨州 256603)

单宁属于天然多酚类物质,广泛存在于植物的茎叶和果实中。单宁是食物和饲料中涩味的主要来源。单宁包含多个酚羟基,能与蛋白质的亚胺基交联成键,形成疏水性沉淀。饲料中单宁与口腔黏膜、唾液以及消化道中的蛋白质结合,高浓度的单宁不利于饲料中营养价值的吸收和利用,单宁也能与金属元素结合,从而降低对矿物元素利用,食物和饲料中都必须控制单宁的浓度,高浓度单宁必须降解去除[1-4]。

降解单宁的主要有3种方法:物理法(高温处理)、化学法(有机溶剂)和生物酶法。其中物理方法耗能高,且乃能消除70%的单宁。化学法主要添加有机溶剂来降低单宁含量,安全性低且容易造成环境污染[5-7]。利用酶法降低单宁含量操作简单,并且节能环保,在生产生活中具有重要价值[8-10]。

单宁酶(EC 3.1.1.20)能水解单宁物质中的酯键,生成没食子酸、葡萄糖及其他醇类化合物。单宁酶是美国食品与药物管理局(food and drug administration,FDA)批准应用的安全食品,我国已将其列入食品添加剂名录。在单宁酶的基础研究及工业应用方面,美国、日本研究得较早。国内对单宁酶的研究较晚,随着市场需求量的不断增加,急需从菌种、生产工艺进行突破,因此,开展微生物发酵生产单宁酶的工艺研究,提高酶活性、稳定性,相对降低酶的价格,对于扩大单宁酶的生产规模,助推国内单宁酶的工业生产具有重要意义[11-15]。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

1.1.1菌种

自行分离,来源于东海、南海、渤海湾的海水、海泥、动植物体表与动物肠道。

1.1.2 培养基

菌种分离培养基:葡萄糖20 g/L,蛋白胨20 g/L,酵母粉10 g/L,海水1 L,氯霉素0.1 g/L,pH自然,琼脂20 g/L,115℃灭菌30 min。

酵母浸出粉胨葡萄糖(yeast extract peptone dextrose,YPD)液体培养基:葡萄糖20 g/L,蛋白胨20 g/L,酵母粉10 g/L,115℃灭菌30 min。

产酶筛选培养基:单宁20 g/L,硝酸铵10 g/L,琼脂30 g/L,溴酚蓝0.002 g/L,115℃灭菌30 min。

产酶发酵培养基:单宁酸10 g/L,硝酸铵20 g/L,葡萄糖20 g/L,pH 5.0,115℃灭菌30 min。

糖发酵测试培养基:葡萄糖、蔗糖、乳糖、半乳糖、蜜二糖、棉子糖、L-阿拉伯糖、D-阿拉伯糖、麦芽糖、木糖制备形成100 g/L的糖母液。将上述糖母液分别装入小试管中,并加入酵母粉,最终控制糖质量浓度为20 g/L,酵母粉质量浓度为10 g/L,每个发酵糖做3个平行,发酵糖试管中加入一个杜氏小管,115℃灭菌30 min。

同化碳源培养基:(NH4)2SO45 g/L,KH2PO41 g/L,MgSO4·7H2O 0.5 g/L,酵母膏0.2 g/L,琼脂20 g/L,115 ℃灭菌30 min。

1.1.3 试剂

0.05 mol/L甲醇罗丹宁溶液,0.01 mol/L没食子酸丙酯,0.5 mol/L KOH溶液,0.1 mol/L柠檬苏-柠檬酸钠缓冲溶液。

1.2 仪器与设备

SPX-180生化培养箱:上海丙林电子科技有限公司;Microfuge1-16K离心机:德国Sigma公司;PHSJ-3FpH数字式酸度计:上海仪电科学仪器股份有限公司;OlimpusCX23显微镜:上海赖氏电子科技有限公司;UV-2102 C型紫外分光光度计:上海圣科仪器设备有限公司;5334聚合酶链式反应(polymerasechain reaction,PCR)仪:德国Eppendorf公司。

1.3 方法

1.3.1 产酶菌种的初筛

采集样品预处理后,制备菌悬液涂布产酶筛选固体培养基上,28℃培养2 d,观察微生物生长情况,选择单菌落点转接在产酶筛选固体培养基上,再培养3 d,观察形成水解圈的情况。通过测量水解圈直径(D)和菌落直径(d),以D/d值作为初筛依据,筛选产酶能力较高的菌株。

1.3.2 单宁酶活力测定

产酶能力较高的菌株在发酵培养基中培养,发酵液16 000 r/min离心10 min得到粗酶液。比色管中分别加入0.5mL没食子酸丙酯溶液,以0.5 mL 0.1 mol/L柠檬酸钠缓冲液为空白对照,测试管加入0.5mL粗酶液,酶解条件为30℃处理5 min,在酶解和对照管中分别加入1.0 mL 0.05 mol/L罗丹宁溶液,30℃处理5 min。在酶解和对照管中加入0.5 mol/L KOH溶液0.5 mL,30℃处理5 min。反应结束后将5 mL蒸馏水分别加入酶解管和对照管中,30℃处理5 min。充分混匀后在波长520nm处测定吸光度值,单宁酶活力根据吸光度值的变化来计算[16-20]。

酶活定义:在pH5.5、30℃的条件下,每分钟产生1μmol/L没食子酸所需要的酶量作为1个酶活单位(U)。

1.3.3 菌种的生理生化鉴定

分别进行糖发酵测试与碳源同化测试。

1.3.4 分子生物学鉴定

(1)对分离的产酶菌株进行基因组提取,在生理生化基础上进行分子生物学鉴定。根据分离菌株的ITS测序结果,与GenBank数据库中保存的已知标准菌株进行同源比对,根据与已知菌株同源序列比对结果通过软件构建ITS系统发育进化树。

(2)海洋菌株95 ITS序列的PCR扩增[8-9]:

ITS序列扩增的引物为:正向引物5'-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3';反向引物5'-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3',采用该引物进行PCR体外扩增,目标产物大约为550 bp。

(3)菌株产酶曲线的测定

产酶菌株在YPD液体培养基中过夜培养作为种子液,以5%的量接入产酶培养基在28℃、160r/min条件下振荡培养96 h,每隔12 h取发酵液16 000 r/min离心10 min,做3个平行样,测定发酵单宁酶活性,并绘制菌株产酶曲线。

1.3.5 粗酶液酶学性质的研究

产酶菌株接种于液体培养基中,培养12 h作为种子液,以5%的量接入产酶培养基在28℃、160 r/min条件下振荡培养72 h,取发酵液离心获得粗酶液。

(1)温度对胞外单宁酶酶促反应的影响[22]

粗酶液分别置于30℃、40℃、50℃、60℃、70℃下进行酶促反应,保持pH=5条件下,分别测定不同温度下酶活性,每个条件测定3次,计算相对酶活。

(2)胞外单宁酶粗酶液的热稳定性[23]

粗酶液稳定性试验,将样品分别在4℃、30℃、40℃、50℃、60℃、70℃条件下放置4h,迅速冷却后,然后在30℃、pH=5.5条件下测定酶活力,计算相对酶活。

(3)pH对酶促反应的影响

以pH=3、4、5、6、7的柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液配制反应底物,加入粗酶液在30℃下进行反应,测定酶活力,计算相对酶活。

(4)胞外单宁酶粗酶的pH稳定性

粗酶加到pH=3、4、5、6、7的柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液在4℃条件下放置4 h,在30℃、pH=5.5条件下测定酶活力,计算相对酶活。

2 结果与分析

2.1 菌种筛选

将分离样品在YPD液体培养基中培养,取50mL菌液点在筛选培养基上,30℃培养48 h,结果如图1所不,透明圈与菌落直径比(D/d值)见表1。结果表明,不同菌种在平板上的生长情况差异明显,81号菌落周围透明圈很小,82号菌生长缓慢,未形成明显透明圈。86号菌落周围出现了明显的透明圈,其半径小。75号菌落接种量较大,菌落变形,菌落周围呈现出清晰的透明圈。95号菌落生长较好,透明圈清晰且较大。参照D/d值,选择95号菌作为研究对象,进行产酶研究。

图1 不同菌株菌落平板水解结果Fig.1 Results of colony plate hydrolysis of different strains

表1 不同菌株透明圈与菌落直径的比Table1 Ratio of transparent circle to colony diameter of different strains

2.2 菌株的菌落和细胞形态

将菌株95号接种至固体YPD平板上,在28℃培养48 h,观察平板上的菌落,通过显微镜观察细胞形态,结果见图2。从图2-A可以看出,菌株95号菌落呈星状,酵母菌常有的乳白色,菌落边缘不规则,较湿润,菌落与营养机制结合紧密;从图2-B可以看出,显微镜下直接观察菌株75号细胞形椭圆形,单个分散,有明显的芽殖体。

图2 菌株95号的菌落形态(A)和细胞形态(B)Fig.2 Colony morphology(A)and cell microscopy(B)of strain 95#

根据酵母菌鉴定方法,糖发酵和碳源同化试验是菌株鉴定的两个重要试验,分离菌株95号的糖发酵试验情况见表2,碳源同化情况见表3。

表2 菌株95号的碳源发酵结果Table2 Carbon fermentation results of strain 95#

表3 菌株95号的碳源同化结果Table3 Carbon assimilation results of strain 95#

由表2和表3可知,菌株95号能够同化多种糖类,但不能够同化乳糖。根据同化与发酵结果,并与酵母鉴定手册的标准数据进行比较,测试菌株95号与Aureobasidium subglaciale标准菌株的碳源发酵和同化结果一致。

2.3 分子鉴定

ITS序列进行比对的结果均表明,单宁酶菌株95与Aureobasidium subglaciale的序列最为接近,数据结果相似性高达99%以上,以标准菌株为标准进行进化树绘制,结果见图3。

图3 菌株95号的系统发育树Fig.3 Phylogenetic tree of strain 95＃

由图3可知,单宁酶菌株95与Aureobasidiumsubglaciale聚类到同一支,分子生物学中ITS鉴定与生理生化鉴定结果一致,最终将分离获得海洋单宁酶菌株95号确定为Aureobasidiumsubglaciale。目前曲霉属是报道中最主要的生产单宁酶菌种[2,10,12,13,16,22],Aureobasidium subglaciale未曾有报道,此外KUMARM等[9-10]从克雷白氏杆菌(Klebsiella),分离获得了目前来源于细菌的最小分子质量的嗜热单宁酶,最优催化温度为50℃,极小阿托波氏菌也被报道可以进行单宁酶的生产[18]。

2.4 菌株95号产酶曲线的测定

菌株95号产酶菌株在YPD液体培养基中过夜培养作为种子液,以5%的量接入产酶培养基在28℃、160 r/min条件下振荡培养,其发酵产酶曲线见图4。由图4可知,菌株95号在发酵前24 h产酶很低,从24 h开始骤然升高,也与菌体密度保持一致,发酵72 h在胞外达到最大活力323.2 U/mL。已报道[8,10,12,17,20]的产单宁酶菌株酶活普遍低于300 U/mL,菌株95号活力较高,且产酶周期类似,说明菌株95号是较好的产酶菌株。

图4 菌株95号发酵产酶曲线Fig.4 The enzyme production curve of strain 95＃fermentation

2.5 酶学性质

2.5.1 温度对胞外单宁酶酶促反应的影响

粗酶液分别置于30℃、40℃、50℃、60℃、70℃条件下进行酶促反应4 h,保持pH=5测定酶活力,每个试验做3个平行样,以50℃下的活力为100%,计算各样品相对酶活力,结果见图5。

图5 温度对胞外单宁酶活力的影响Fig.5 Effect of temperature on enzyme activity of extracellular tannase

由图5可知,该酶最适反应温度为60℃,在40～70℃之间能保持较高的酶促反应速率。当反应温度升高且低于50℃时,酶促反应的底物能量增加同时活化的分子数增多,提高了分子间的碰撞概率,使得同等条件下酶促反应速度加快;而酶蛋白在过高的温度下结构会发生变化,逐渐变性,活性降低。根据文献报道[21-22],多数单宁酶在0～45℃之间保持较高的酶活性。可见菌株95号所产的单宁酶保持活力的温度范围更宽,有较强的应用潜力[4,6,7,10]。

2.5.2 胞外单宁酶的热稳定性

以常见低温保藏酶温度4℃开始、选择30℃、40℃、50℃、60℃、70℃分别保存粗酶液4 h,流水迅速冷却后,然后在30℃、pH=6条件下测定酶活力,以初始活力为100%,计算各样品的相对酶活力,结果如图6。由图6可知,在30℃、40℃、50℃水浴保温4 h,相对酶活力为80%以上,从60℃开始活力下降明显。此外该单宁酶在30～60℃条件下保温4 h活力无明显下降,70℃温度较高,酶已经失活。已报道[23-24]的多数单宁酶在60℃保温1 h,酶活力几乎完全丧失,本研究得到的胞外单宁酶热稳定性高于现有绝大多数单宁酶,可满足食品加工工艺中处理时间的要求。

图6 温度对胞外单宁酶酶的热稳定性的影响Fig.6 Effect of temperature on the thermal stability of extracellular tannase

2.5.3 pH对酶促反应的影响

以pH=3、4、5、6、7、8的柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液配制反应底物,加入粗酶在30℃条件下进行反应,以pH 6条件下的活力为100%,计算各样品相对酶活力,结果见图7。如图7所不,胞外单宁酶最适反应pH为6,pH在3～7之间均有较高反应速率。这与文献报道[18,20,22]的大部分单宁酶酶促反应最适pH在4.5～6.0之间相符。

图7 pH值对酶促反应的影响Fig.7 Effect of pH value on enzymatic reaction

2.5.4胞外单宁酶的pH稳定性

粗酶加到柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液(pH=3、4、5、6、7)在4℃条件下放置4 h,在30℃、pH=6条件下,以初始活力为100%,计算各样品的相对酶活力结果见图8。该单宁酶具有较广的pH值稳定性,在pH值4～7之间相对酶活为60%以上。文献报道单宁酶多为酸性蛋白,其性质可能与此相关。

图8 胞外单宁酶酶的p H值稳定性Fig.8 Stability of pH value of extracellular tannase

3 结论

本研究从海洋微生物中筛选到高产单宁酶的菌株95号,综合生理生化和分子生物学鉴定结果,该菌株鉴定为Aureobasidium subglaciale,其在发酵培养基中培养72 h达到最大活力323.2 U/mL,与其他产单宁酶微生物相比达到了较高的产酶水平。该菌株所产单宁酶最适反应温度为50℃,该酶在30℃、40℃、50℃水浴保温4 h,相对酶活80%以上,具有较好的热稳定性;单宁酶最适反应pH和最稳定pH均为6,同时酶具有较广的pH值稳定性。本研究中的单宁酶保持活力的条件较为广泛,与茶叶加工、果汁制作的工艺条件接近,所以此单宁酶在去除茶叶冷后浑浊、果汁饮料除涩方面有较好的应用优势。Aureobasidiumsubglaciale单宁酶的发酵研究,拓宽了单宁酶种植资源,同时本研究中的单宁酶具有良好的热稳定性和pH稳定性,有较大的应用潜力。