绵马贯众不同萃取部位总间苯三酚含量的测定

刘计权，王菊平，曹天文，贺润丽

（1.山西中医药大学，山西太原030024； 2.山西省农业科学院，山西太原030006）

绵马贯众为鳞毛蕨科植物粗茎鳞毛蕨（Dryopteris crassirhizomaNakai）的干燥根茎及叶柄残基。味苦，微寒，有小毒，归肝、胃经。具有清热解毒、驱虫的功效［1］。现代研究认为，绵马贯众富含五十多种间苯三酚类化合物［2］，这些间苯三酚类化合物具有抗疟［3］、抗肿瘤、抗菌、抗病毒和杀血吸虫［4-5］等功效。本文以间苯三酚为对照品，经间苯三酚类成分的专属性显色剂坚牢蓝BB盐溶液显色［6］，采用可见分光光度法，测定了绵马贯众不同萃取部位总间苯三酚的含量。

1 仪器与试药

Hitachi U-2000紫外可见分光光度计（日本日立公司）。间苯三酚对照品（上海时代生物科技有限公司，批号 100389-200301，纯度＞99%），坚牢蓝BB盐（北京Solarbio科技有限公司生产）。绵马贯众药材购自北京同仁堂药店，经鉴定为鳞毛蕨科植物粗茎鳞毛厥（Dryopteris crassirhizomaNakai）的干燥根茎及叶柄残基。

2 研究方法

2.1 对照品溶液的制备

精密称取对照品间苯三酚0.1 g，置于100 mL容量瓶中，加入70%乙醇适量，置30℃水浴上微热使溶解，冷却后用70%乙醇定容至刻度，摇匀，制得1 mg/mL对照品母液。精密吸取1 mL对照品母液置于100 mL容量瓶中，用70%乙醇定容至刻度，摇匀，即得0.01 mg/mL对照品溶液。

2.2 供试品溶液的制备

用电子天平称取过60目绵马贯众药材粉末1 g，精密称定，精密加入70%乙醇100 mL，称重，回流提取1 h，冷却至室温，称重、补重，混匀，过滤，弃去初滤液，精密量取续滤液1 mL置于100 mL容量瓶中，用70%乙醇定容至刻度，摇匀，即得供试品溶液。

2.3 显色剂的配制

精密称定坚牢蓝BB盐粉末0.5 g，置100 mL容量瓶中，加少量70%乙醇溶解，并用蒸馏水定容至刻度，摇匀，即为0.5%坚牢蓝BB盐溶液。取适量上述溶液，并用蒸馏水稀释分别制得0.3%、0.1%坚牢蓝BB盐溶液。

2.4 测定波长的选择

精密量取对照品溶液和供试品溶液各1 mL，分置10 mL具塞刻度试管中，用70%乙醇定容至2 mL，精密加入0.5%坚牢蓝BB盐溶液3 mL，放置10 min。于400～800 nm波长范围内扫描测定，测得对照品和供试样品溶液络合前后的差示吸收光谱均在476 nm处有最大的差示吸光度值，故选择476 nm作为测定波长测定吸光度。

2.5 显色条件考察

采用L9（34）正交试验表，以对照品对显色剂浓度、显色时间和显色剂用量进行显色条件考察。显色条件因素水平表见表1。

表1 显色条件因素水平表

3 测定结果

3.1 显色条件考察的正交试验结果

显色条件考察的正交试验结果见表2。

由表2数值进行直观分析可以看出，各因素作用的主次为A＞C＞B，初步确定最佳显色条件为A3B3C3。为进一步明确各因素水平变化对实验结果是否具有显著影响，进行方差分析，结果见表3。

表2 显色条件正交试验结果表

表3 显色条件正交试验方差分析表

表3方差分析结果显示，显色剂浓度和用量对实验结果有显著性影响，而显色时间对实验结果无显著性影响。从节省时间的角度考虑，确定最佳显色条件为A3B1C3，即用0.5%坚牢蓝BB盐溶液3 mL，室温放置10 min显色。

3.2 显色稳定性考察

精密量取对照品溶液2 mL，置于10 mL具塞刻度试管中，按上述最佳显色条件显色后，继续放置2 h，并每隔30 min测定1次吸光度。测定结果表明，显色后的溶液在2 h内稳定，RSD=1.76%.

3.3 显色剂稳定性考察

精密吸取对照品溶液2 mL，置于10 mL具塞刻度试管中，按上述最佳显色条件显色、测定，显色剂配置后每隔2 h对对照品溶液显色测定1次吸光度，测定结果表明，显色剂在8 h内稳定，RSD=2.30%。

3.4 线性关系考察

精密吸取已配制好的0.01 mg/mL的对照品溶 液 0.2 mL、0.4 mL、0.6 mL、0.8 mL、1.0 mL、1.2 mL，分别置于10 mL具塞刻度试管中并依次标号，用70%乙醇稀释至2 mL，按最佳条件显色，以70%乙醇为空白，测定吸光度。

以吸光度为纵坐标，对照品的取样量（μg）为横坐标作图，进行线性回归得回归方程y=0.049 2x+0.018 3，r=0.999 6，F=49.2＞F0.01（1，4）=21.2，回归关系极显著。结果表明对照品在2～12 μg之间显色后吸光度值与对照品取样量呈良好线性关系。

3.5 精密度试验

精密量取已配制好的对照品溶液1 mL，置于10 mL具塞刻度试管中，平行操作6份，按上述最佳条件定容显色、测定，测得吸光度平均值为0.514，RSD=1.37%，表明显色的精密度良好。

3.6 供试品溶液稳定性考察

精密吸取供试品溶液1 mL，置于10 mL具塞刻度试管中，按上述最佳条件定容显色，继续放置90 min，并每隔10 min测定1次吸光度。测定结果表明，供试品溶液显色后在90 min内稳定，RSD=1.55%.

3.7 重复性试验

精密称取过60目绵马贯众药材粉末6份，每份0.5 g，按上述方法配制供试品溶液，并以上述最佳显色条件显色、测定，测得总间苯三酚的平均含量为 10.03%，RSD=1.03%。测定结果表明，重复性良好。

3.8 加样回收率试验

精密称取已知总间苯三酚含量（平均含量为10.03%）的绵马贯众药材粉末约 0.045 g，平行操作6份，分别精密加入对照品溶液（1 mg/mL）4.5 mL，按上述供试品溶液制备方法制备供试品溶液，并以上述最佳显色条件显色、测定吸光度，计算回收率。测定结果表明，平均回收率为99.76%，RSD=2.17%，该法加样回收率良好。结果见表4。

表4 加样回收率试验（n=6）

3.9 不同萃取部位总间苯三酚含量的测定

取绵马贯众药材粉末按上述方法回流提取，提取物上旋转蒸发仪减压浓缩至稠膏状，然后取1.113 g浸膏用适量蒸馏水溶解后，采用液-液分离法，依次用石油醚、氯仿、乙酸乙酯、正丁醇进行萃取，经过浓缩后制得石油醚部、氯仿部、乙酸乙酯部、正丁醇部和水部的萃取物。萃取物经干燥称重后用70%乙醇稀释，制备各萃取部位供试品溶液，以70%乙醇溶液作为空白，按上述最佳显色条件显色、测定吸光度，带入回归方程计算各萃取部位总间苯三酚的含量。测定结果见表5。

表5 不同萃取部位总间苯三酚含量（n=3）

4 讨 论

实验结果表明，绵马贯众总间苯三酚在不同萃取部位中的含量差异很大，在5个萃取部位中以氯仿萃取部位的总间苯三酚含量最高，其次为乙酸乙酯萃取部位，正丁醇萃取部位和石油醚萃取部位中的总间苯三酚含量较低，水萃取部位中不含有间苯三酚类化合物。

文献报道，绵马贯众具有杀虫、抑菌和抗病毒等作用，其中间苯三酚类化合物是其发挥药理作用的主要物质基础［2］。作者前期研究了绵马贯众不同萃取部位的杀线活性，研究结果表明，氯仿萃取部位的杀线活性最强（LC50=0.39 mg/mL），乙酸乙酯萃取部位、正丁醇萃取部位和石油醚萃取部位的杀线活性依次降低，水部萃取物的杀线活性最弱（LC50=1.85 mg/mL），绵马贯众不同萃取部位的杀线活性与各部位中总间苯三酚的含量呈现明显的正相关，即总间苯三酚的含量越高，其杀线活性越强［7］，后期在研究绵马贯众不同萃取部位防治黄芪白粉病和黄芪蚜虫的实验中得到了相同的结论。

文献报道以绵马贯众素ABBA为对照品对绵马贯众的总间苯三酚含量进行了测定，测得总间苯三酚类化合物的平均含量为10.90%［8］。本实验以间苯三酚为对照品对绵马贯众的总间苯三酚含量进行了测定，测得绵马贯众中总间苯三酚类化合物的平均含量为10.03%。两种方法相比，测定结果无显著差异，说明本方法准确可行，而且对照品容易获得。

在回流提取制备供试品溶液的实验中，考察了70%、80%和90%乙醇三种浓度的提取效果，测定结果显示三种浓度提取对总间苯三酚的含量没有显著影响，从经济和节约的角度考虑，最后选用70%的乙醇作为适宜的提取溶剂浓度。