miR-300通过靶向BRD7对肝癌细胞增殖与侵袭的影响

邓爱民 李建华

(郑州澍青医学高等专科学校，河南 郑州 450064)

目前，针对肝癌最有效的治疗方法是手术治疗〔1〕，然而85%的患者在诊断时已发生远处转移，单纯的手术切除甚至肝脏移植都不能获得很好的治疗效果〔2〕。MicroRNA(miRNAs)为单链非编码小分子RNA，通过与靶基因互补结合抑制基因的蛋白翻译或者降解mRNA使基因的表达水平下调。研究发现，miRNAs通过调节细胞增殖、凋亡、侵袭和转移等过程参与肿瘤的发生发展〔3〕。同样，许多miRNAs在肝癌的发生过程中发挥重要作用。比如miR-135a通过作用于FOXO1促进肝癌细胞的迁移和侵袭过程〔4〕。而miR-300在骨肉瘤和胃癌组织中均有较高的表达水平，在骨肉瘤中miR-300通过靶向下调溴含蛋白质(BRD)7参与肿瘤的增殖和侵袭过程，但是关于miR-300在肝癌中发挥作用的研究较少。本文运用肝癌细胞系HepG2和Hep3b，探讨miR-300对肝癌细胞增殖和侵袭的影响，并通过过表达实验判断miR-300的靶基因BRD7是否参与该过程。

1 材料与方法

1.1细胞与质粒 人肝癌细胞系HepG2、Hep3b和人胚肾上皮细胞293T细胞由中国科学院上海细胞库提供，其中HepG2和Hep3b生长于RPMI1640培养基中〔含10%灭活胎牛血清(FBS)、青霉素(100 U/ml)、链霉素(100 μg/ml)、2 mmol/L L-谷氨酰胺〕。293T细胞生长于10% FBS DMEM培养基中。内参质粒为海肾荧光素酶的质粒pRL-TK，购自美国 Promega 公司。pGL3-control报告质粒由本实验室提供，同时本实验室将质粒(序列为BRD7 3′UTR)插入pGL3-control虫荧光素酶序列下游，测序后命名为pGL3-BRD7 3′UTR。miRNAs定量引物(广州锐博生物科技公司)。上海吉玛制药技术有限公司合成miR-300模拟物(mimic)和阴性对照(NC)。

1.2荧光素酶实验 将293T细胞(规格为2×104个/孔)接种于48孔板，同时加入0.2 ml DMEM培养基孵育。次日，根据LipofectamineTM 2000(Invitrogen，CA，USA)说明书在293T细胞内将miR-300 mimic和NC分别与pGL3-control或pGL3-BRD7 3′UTR及pRL-TK质粒共同转染。转染48 h后，收集细胞，应用GLOMAX多功能酶标仪分析荧光素酶。

1.3实时荧光定量PCR(qRT-PCR)检测miRNAs的表达 于实验前1 d在6孔板中铺入5×104HepG2和Hep3b，次日细胞贴壁，细胞汇合度在60%～70%，依据LipofectamineTM 2000说明书操作，将miR-300 mimic和NC分别转染入HepG2和Hep3b细胞，转染48 h后，Trizol试剂提取总RNA，按照SYBR®Premix Ex TaqTM(Tli RNaseH Plus)说明书建立反转录体系，qRT-PCR实验的操作由ABI7300定量PCR仪完成。所用引物序列见表1。反应温度： 95℃ 30 s 预变性，95℃ 5 s，60℃ 31 s 循环40次。Ct值按照Applied Biosystem公司 ABI PRISM 7700 Sequence Detection System User Bulletin #2推荐方法获得，并进行计算，比较目的基因在细胞中的表达水平。采用Real-Time PCR仪器(ABI公司，型号：7900)进行分析，结果根据2-ΔΔCt法进行计算。

1.4Western印迹检测 在293T细胞中完成miR-300 mimic和NC的转染过程，转染48 h后，收集细胞，完成Western印迹实验。将200 μg/孔加入酶标板中，在电压恒定为60 V的条件下，电泳0.5 h，当蛋白进入分离胶后，在电压恒定为110 V的条件下，电泳1.5 h，然后在电流恒定为80 mA的条件下，将蛋白转膜100 min至聚偏氟乙烯(PVDF)膜，然后用 5%脱脂牛奶37℃封闭 1 h，Tris盐酸缓冲液(TBS-T)洗 5 min，洗1 次；加入以抗体稀释液 1∶1 000配制的鼠抗人BRD7(Santa Cruz,USA)抗体4℃ 过夜，TBS-T洗 10 min共3次； 加入抗体稀释液 1∶4 000配制的辣根过氧化物酶(HRP)标记的山羊抗小鼠IgG，37℃作用1 h，使用TBS-T清洗3次，每次10 min，采用增强化学发光法(ECL)检测荧光度。使用抗体稀释液 1∶1 000配制的抗α-tubulin作为一抗，二抗为抗体稀释液 1∶4 000 配制的 HRP标记的山羊抗小鼠IgG。

1.5CCK-8增殖实验 实验前24 h，在HepG2和Hep3b细胞完成miR-300 mimic和NC的转染过程，第2天在96孔板中接种胰酶消化细胞(3 000个/孔)，CO2培养箱温度设置为37℃，浓度为5%，培养5 d内每天每孔中加入10 μl CCK-8，培养1 h，空白孔作为对照，调零，波长设置为450 nm，采用Bioteck DR-3506全自动酶标仪测量OD值。

1.6Matrigel侵袭实验 RPMI1640 混合液〔2份基质胶(BD Biosciences，USA)和1份RPMI1640 培养基〕置于冰上。24 孔板中加入Transwell 小室(Merck Millipore,Darmstadt,德国)，在每个小室中加入RPMI-1640 混合液，体积为60 μl，将500 μl 10%FBS RPMI1640培养基加入下室，CO2培养箱温度设置为37℃，浓度为5%，培养5 h。使用RPMI1640培养基配制成细胞悬液(5×105个/ml)消化转染有miR-300 mimic和NC的细胞。将200 μl 细胞悬液加入小室内，平行做3次。把24孔板放置在细胞培养箱中，培养6 h和12 h后进行小室染色固定，应用CARL ZEISS LSM 510显微镜计数，通过统计下室的细胞数量评估细胞侵袭状态。

1.7统计学方法 应用SPSS17.0软件行方差分析、t检验。

2 结 果

2.1过表达miR-300促进肝癌细胞的增殖 将miR-300 mimic和NC分别转染入HepG2和Hep3b细胞，qRT-PCR首先检测miR-300的表达水平，与转染NC比较，转染miR-300 mimic后，HepG2和Hep3b细胞中miR-300的表达水平均上升〔(4.30±0.61)vs(1.00±0.30)，(5.60±0.30)vs(1.00±0.25)〕，差异具有统计学意义(t=8.521，20.403；P=0.001，0.000)。接着进行CCK-8增殖实验结果显示，在实验第3、4、5天，转染miR-300 mimic组HepG2细胞的增殖能力与NC组比较差异有统计学意义(P<0.05)；同样，在实验第3、4、5天，转染miR-300 mimic组Hep3b细胞的增殖能力与NC组比较差异有统计学意义(P<0.05)，提示过表达miR-300后细胞的增殖能力明显高于对照组。见表2。

表2 转染后不同时间点过表达miR-300促进肝癌细胞的增殖

与NC组比较：1)P<0.05,与第1天比较：2)P<0.05

2.2过表达miR-300促进肝癌细胞的侵袭 Matrigel侵袭实验结果发现，HepG2细胞在6 h或12 h侵袭到小室底部的细胞数，转染miR-300 mimic组多于NC组，差异有统计学意义(P<0.05)。同样，Hep3b细胞在6 h或12 h侵袭到小室底部的细胞数，转染miR-300 mimic组多于NC组(P<0.05)，提示过表达miR-300明显促进HepG2和Hep3b细胞的侵袭能力。见表3。

表3 培养不同时间过表达miR-300促进肝癌细胞的侵袭

与6 h比较：1)P<0.05

2.3miR-300靶向作用于BRD7 荧光素酶双报告实验结果显示，miR-300能显著抑制pGL3-BRD7 3′UTR虫荧光素酶报告质粒的活性，差异具有统计学意义(P<0.05)，见表4。进一步通过将miR-300 mimic与NC分别转染入293T细胞，利用Western印迹实验检测BRD7的表达水平，结果显示，与转染NC相比，转染miR-300 mimic后的293T细胞中BRD7的蛋白表达水平明显下调，见图1，提示miR-300通过直接靶向BRD7并抑制其表达。

2.4过表达BRD7抑制肝癌细胞的增殖过程 为了说明BRD7是否参与miR-300促进肝癌细胞的增殖过程，将BRD7质粒及对照分别转染入过表达NC和miR-300 mimic的HepG2和Hep3b细胞中进行CCK-8增殖实验。在HepG2组中，第3、4、5天，miR-300 mimic+对照质粒组细胞增殖能力与NC+对照质粒组比较，差异均有统计学意义(P<0.05)；而第3、4、5天，NC+对照质粒组细胞增殖能力均高于NC+BRD7组，差异均有统计学意义(P<0.05)；且第3、4、5天，miR-300 mimic+对照质粒组细胞增殖能力与miR-300 mimic+BRD7组比较，差异均有统计学意义(P<0.05)。而Hep3b中CCK-8的结果与HepG2的结果一致。以上结果说明过表达BRD7后能明显抑制肝癌细胞的增殖能力。见表5。

表4 miR-300靶向作用于BRD7比较

图1 Western印迹检测BRD7蛋白表达水平

表5 转染后不同时间点过表达BRD7抑制肝癌细胞的增殖过程

整体分析为两因素重复测量方差分析；组间两两比较为LSD-t检验；1)2)3)分别为与NC+对照质粒组，NC+BRDT组，miR-300 mimic+对照质粒组比较：P<0.05；时间两两比较为差值t检验；与第1天比较：4)P<0.05

2.5过表达BRD7抑制肝癌细胞的侵袭过程 为了说明BRD7是否参与miR-300促进肝癌细胞的侵袭过程，在转染入NC和miR-300 mimic的细胞HepG2中分别过表达BRD7质粒及对照质粒，进行Matrigel 侵袭实验，结果显示，无论6 h还是 12 h，过表达 BRD7 后HepG2细胞的迁移能力均明显减弱，差异具有统计学意义(P<0.05)；同样，无论6 h还是12 h，过表达 BRD7后Hep3b细胞的侵袭能力均明显减弱，差异具有统计学意义(P<0.05)，提示miR-300通过靶向BRD7促进肝癌细胞的侵袭能力。见表6。

表6 培养不同时间过表达BRD7抑制肝癌细胞的侵袭过程

整体分析为两因素重复测量方差分析；组间两两比较为LSD-t检验；1)2)3)分别为与NC+对照质粒组，NC+BRD7组，miR-300 mimic+对照质粒组比较：P<0.05；时间两两比较为差值t检验；与12 h比较：4)P<0.05

3 讨 论

从肝炎病毒感染到肝癌的发生包括一系列过程，如病毒导致持续的肝损伤发展为肝硬化、肝衰竭最后发展为肝癌〔5〕。证据表明，miRNAs在肿瘤发生的早期至晚期过程中都发挥重要作用〔6〕。许多特征性的miRNAs表达谱在肝脏疾病中发生变化。而对这些miRNAs作用的深入研究将为miRNAs作为肿瘤诊断、分期、预后等潜在的非侵入性的生物标记提供理论基础。本研究发现，过表达miR-300可以促进肝癌细胞的增殖和侵袭过程，且验证了BRD7为miR-300的靶基因，当过表达BRD7时肝癌细胞的增殖和侵袭过程受到抑制。以上结果得出结论：miR-300通过靶向BRD7促进肝癌细胞的增殖和侵袭过程。

研究表明，miR-300同时具有促癌及抑癌作用〔7,8〕。miR-300在神经胶质瘤中高表达，过表达miR-300可以促进胶质瘤干细胞的自我更新、增殖〔9〕。而在头颈鳞状细胞癌中和乳腺癌中miR-300表达水平较低〔10〕，过表达miR-300可以阻止乳腺癌细胞MDA-MB-231中转化生长因子(TGF)-β诱导的上皮间质转化。但在本实验发现miR-300具有促进肝癌细胞增殖与侵袭的作用，验证了BRD7为miR-300的靶基因，BRD7属于BRD家族，在心脏、肺、结肠和乳腺等多种组织中普遍表达。免疫荧光实验发现BRD7定位于细胞核中，可与乙酰化组蛋白H3结合，从而调节染色质重塑。BRD7在结肠癌和鼻咽癌中表达水平较低，过表达BRD7通过细胞周期阻滞抑制鼻咽癌细胞的增殖〔11〕；另外的研究表明，BRD7抑制前列腺癌细胞的增殖；而敲低BRD7可以促进p85α在细胞质聚集，从而稳定p110的表达水平，促进PI3K信号通路的激活〔12〕。本研究发现，miR-300可以靶向下调BRD7的蛋白水平，而过表达BRD7可以抑制肝癌细胞的增殖和侵袭过程，该发现与BRD7为抑瘤基因的结果一致，但miR-300是否通过抑制BRD7的表达间接激活PI3K信号通路发挥该作用仍需进一步研究。