双参通脉颗粒对大鼠心肌缺血再灌注损伤的保护作用*

陈 卓，李文杰，杨 莺

(1. 辽宁中医药大学，沈阳 110847； 2. 辽宁中医药大学附属医院，沈阳 110032)

心肌梗死是中老年人心血管系统病变中最严重的致死因素。近年来，介入治疗广泛应用于急性心肌梗死，因此如何改善心肌缺血再灌注损伤成为亟待解决的问题。双参通脉颗粒具有益气养阴、活血通络的功效。本实验通过结扎大鼠左冠状动脉前降支的方法制备心肌缺血模型，以研究双参通脉颗粒对大鼠缺血再灌注损伤的保护作用。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 药品与试剂 双参通脉颗粒(ginseng and salvia granules for promoting blood flow，GSG)(辽宁中医药大学附属医院院内制剂)主要成分组成：人参、丹参、黄芪、麦冬、川芎、当归；合心爽(盐酸地尔硫卓片，Diltiazem hydrochloride，DH)(天津田边制药有限公司)；谷胱甘肽过氧化物酶(Glutathione peroxidase，GSH-PX)；过氧化氢酶(Catalase，CAT)、内皮素-1(Endothelin -1，ET-1)，髓过氧化物酶(myeloperoxidase，MPO)；酶联免疫分析(ELISA)试剂盒(凯基生物有限公司)，核转录因子-κB(Nuclear transcription factor kappa B，NF-κB)，IκB激酶β(Inhibitor kappa B kinaseβ,IKKβ)抗体(美国Cell Signaling公司)，TUNEL细胞凋亡检测试剂盒(上海前尘生物科技公司)；4%多聚甲醛、蛋白酶K、PBS缓冲液、0.1 M枸橼酸缓冲液(上海前尘生物科技公司)等。

1.1.2 实验仪器 MP150多导生理信号采集系统(德国Leica公司)、高速台式离心机(德国Eppdendorf公司)、BB23型培养箱(美国PE公司)、ROTEAN电泳系统(美国Bio公司)、冰冻切片机OM3123型(瑞典Bio公司)、恒温恒湿箱(上海科技生物公司)、多功能酶标仪(美国Cell Signaling公司)等。

1.2 方法

1.2.1 心肌缺血模型的复制 健康SD大鼠40只，术前禁食12 h，参照文献[1]方法造模：2.5%戊巴比妥腹腔注射，麻醉成功后大鼠仰卧位固定于手术台，气管切开，呼吸机辅助呼吸(频率85次/min,潮气量18 ml,呼吸比1∶1)，连接心电检测仪，术中记录Ⅱ导联心电图。颈部、心前区剪毛，碘伏消毒，于胸骨左侧第3肋间切口，逐层钝性分离皮下组织，沿肋间分离肋骨，进入心包暴露心脏，左右各上一眼科用小拉钩使心脏暴露充分，找到左心耳，于肺动脉圆锥与左心室交界处下方确定结扎位置，以6-0号带线缝合针在冠状动脉左前降支(Left anterior descending coronary artery，LAD)下方2 mm处结扎，进针深度约2 mm，心电图监测到ST段抬高0.2mv左右即为造模成功，持续30 min后打开结扎线，再灌注120 min。关胸并抽出胸腔积气积液，拔出引流管。

1.2.2 实验动物分组与给药 健康成年SD大鼠，体质量280～300 g，按随机数字表法分为6组各10只。假手术组(sham operation group，Sham)：生理盐水灌胃，每日1次，连续4周，只开胸不结扎；模型组(myocardial ischemia reperfusion injury group，MIRI)：生理盐水灌胃，每日1次，连续4周，开胸结扎LAD30 min，再灌注120 min；合心爽治疗组(diltiazem hydrochloride group，DH)：DH灌胃，4.23 mg/kg，每日1次，连续4周，开胸结扎LAD30 min，再灌注120 min；双参通脉颗粒低剂量组(GSG-L)：GSG灌胃，按大鼠体表面积给药，相当于生药量6.34 g/kg，每日1次，连续4周，开胸结扎LAD30 min，再灌注120 min；双参通脉颗粒中剂量组(GSG-M)：给药方法同上，相当于生药量11.16 g/kg；双参通脉颗粒高剂量组(GSG-H)：相当于生药量15.62 g/kg。

1.2.3 血流动力学测定 取材前分离右侧颈总动脉，左心导管插管至左心室，由 ALC-MPA 多导生物信号分析系统记录血流动力学参数。

1.2.4 血清GSH-PX、CAT、ET、MPO测定 经腹主动脉负压采血 2～10 ml,3000 r/min离心取血清试管编号，ELISA法检测血清GSH-PX、CAT、ET、MPO含量。按试剂盒说明书进行操作：将所用抗原用包被稀释液稀释到适当浓度，5%小牛血清置37 ℃封闭40 min，洗涤液满孔洗涤3遍各3 min，将稀释好的样品加入酶标反应孔中,每样品至少加双孔，37 ℃ 40～60 min，加入酶标抗体，37 ℃ 30～60 min，加入底物液，37 ℃避光放置3～5 min,加入终止液显色，20 min内测定实验结果。

1.2.5 心肌组织病理观察 取左心室中部心肌组织连续2 块厚约2～3 mm，标本固定于4%多聚甲醛中，观察时各级乙醇脱水，石蜡固定进行常规切片，再于二甲苯、各级乙醇中脱水，苏木精-伊红(HE)染色，二甲苯透明、中性树胶封片，光镜下观察左心室组织学改变。

1.2.6 TUNEL法检测细胞凋亡 心肌组织石蜡包埋、切片、脱水、蛋白酶孵育，加TUNEL反应液，37 ℃静置1 h，加DAB苏木素复染，梯度酒精脱水，二甲苯透明、封片。显微镜下正常心肌细胞核蓝色，凋亡细胞核为棕褐色。每张切片于相同区域选取5个高倍视野计数，所占总细胞数百分比即为凋亡指数。

1.2.7 心肌NF-κB、Iκκβ蛋白表达 组织蛋白提取：取组织块加液氮研磨，加入RIPA 裂解液，漩涡混匀放置1 h，4℃ 13000 r离心20 min，检测蛋白浓度，计算需要的蛋白上样量，SDS 聚丙烯酰胺凝胶电泳。电泳结束后，电压100 V，恒压转膜90 min，将蛋白转移到硝酸纤维膜上。转膜完成用牛奶封闭1 h，再用 PBST溶液洗膜3次，每次7 min；加入一抗孵育4 h，PBST洗膜3次，每次7 min。加入溶有鼠或兔二抗的牛奶孵育1 h，PBST洗膜3次，每次10 min，加显色液显色，在暗室中显影，用ImageJ软件进行western blot蛋白定量分析。

1.3 统计学方法

2 结果

2.1 各组大鼠造模前后Ⅱ导联心电图(ECG)变化

图1显示，各组大鼠给予左冠状动脉前降支结扎后ECGST段均有不同程度升高，介于0.1～0.3 mv之间，证明各组大鼠心肌缺血模型复制成功。

2.2 左心室功能检测

表1显示，治疗结束后大鼠各项血流动力学参数都发生了改变，反映左心室收缩功能的指标(Left ventricular systolic function,LVSF)明显降低(P<0.05)，反映左心室舒张功能的指标(Left ventricular diastolic function，LVDF)显著升高(P<0.05)；各组心率(Heart rate,HR)变化较大，GSG治疗后大鼠各项血流动力学参数都有显著改善，其中高剂量组改善最明显。

图1 各组大鼠手术前后Ⅱ导联ECGST段变化注：A. Sham组；B.MIRI组；C.DH组；D.GSG-L组；E.GSG-M组；F.GSG-H组

组 别鼠数LVSF( mmHg)LVDF( mmHg)HR(t/min)beforeafterD-valueSham10114.1±2.75.7±0.2366.5±1.4382.9±4.117.3±3.3MIRI1090.6±4.3■12.1±0.7■378.1±2.4421.4±1.738.7±5.8■DH10109.3±1.68.3±0.3370.4±5.2387.3±6.116.8±2.1GSG-L10121.5±0.6*6.9±1.7*361.3±3.6374.1±7.611.5±1.4*GSG-M10119.3±3.3*6.1±0.6*360.8±4.2377.6±2.713.1±2.4*GSG-H10124.7±2.9#5.9±1.1#372.1±2.4379.4±3.16.4±4.6#F值7.134#3.264#——4.164#

注：■P<0.05 vs Sham，#P<0.01，*P<0.05 vs MIRI

2.3 心肌组织病理变化

图2显示，Sham组：心肌细胞排列紧密、规整、间隙小，未发现有明显水肿区域存在，肌纤维无明显扭曲；心肌细胞膜完整、界限清晰、细胞核位置居中，细胞间隙无红细胞出现，炎症浸润；MIRI组：肌纤维扭曲紊乱亦有部分纤维断裂，细胞肿胀变大，组织间隙增宽，水肿现象明显，炎细胞浸润布满视野，细胞间隙可见大量红细胞存在，出血情况严重，细胞核散乱无规律； DH组：炎细胞浸润明显，红细胞渗出较多，而细胞间的水肿情况有所好转，肌纤维断裂现象较少；GSG-L组：与模型组比较损伤显著降低，显微镜下观察时细胞边界清晰，轮廓完整，组织间隙仍有不同程度水肿，但整体较轻，红细胞渗出较多；GSG-M组：心肌细胞排列尚规整，水肿区域较小，肌纤维无断裂，炎症不明显；GSG-H组：细胞边界轮廓尚清晰，组织间隙有轻微水肿，肌纤维偶有断裂，红细胞渗出较少。

2.4 血清GSH-PX、CAT、ET、MPO含量变化及心肌细胞凋亡

2.4.1 血清GSH-PX、CAT、ET、MPO含量变化 表2显示，心肌缺血时ET、MPO含量迅速增加，GSH-PX、CAT含量下降，给予GSG干预后ET、MPO均有下降，GSH-PX、CAT含量上升，与MIRI组比较差异有统计学意义(P<0.05)；与Sham组比较，MIRI组心肌细胞凋亡指数显著升高(P<0.05)；与MIRI组比较，DH组心肌细胞凋亡指数明显下降(P<0.05)；与MIRI组比较，GSG各剂量组心肌细胞凋亡指数明显下降(P<0.05)。

注：A. Sham组；B. MIRI组；C. DH组；D.GSG-L组；E.GSG-M组；F.GSG-H组图2 各组大鼠心肌病理炎症损伤程度变化比较(HE染色，光镜×200)

表2 GSG对心肌缺血大鼠血清GSH-PX、CAT、ET、MPO影响比较

注：■P<0.05 vs Sham，#P<0.01，*P<0.05 vs MIRI

2.4.2 心肌细胞凋亡 图3显示心肌细胞凋亡指数: Sham组心肌组织未见明显凋亡的细胞；MIRI组心肌组织中凋亡细胞较多、较密集；DH组凋亡细胞较MIRI组减少；GSG-L组凋亡细胞较MIRI组减少；GSG-M组凋亡细胞较GSG-L组减少；GSG-H组凋亡细胞较MIRI组减少。

注：A. Sham组；B.MIRI组；C.DH组；D.GSG-L组；E.GSG-M组；F.GSG-H组图3 各组大鼠心肌组织细胞凋亡(HE染色，光镜×200)

2.5 心肌组织NF-κB、Iκκβ蛋白表达

图4、5显示，MIRI组NF-κB蛋白表达较Sham组明显升高(P<0.05)，给予DH及GSG后，各组NF-κB蛋白表达均有不同程度降低(P<0.05)。MIRI组Iκκβ蛋白表达较Sham组明显降低(P<0.05)，给予DH及GSG后，各组Iκκβ蛋白表达均有不同程度降低(P<0.05)。

注：*P<0.05 vs Sham；#P<0.05 vs MIRI；**P<0.01 vs MIRI图4 心肌组织NF-κB蛋白表达比较

图5 心肌组织Iκκβ蛋白表达比较

3 讨论

心肌缺血氧化损伤过程中，氧自由基产生过多，炎性介质大量释放，内皮功能损伤，细胞凋亡[1]。正常状态下，人体氧自由基生成与清除处于动态平衡，并可以在GSH-PX与CAT的催化下还原成氧和水[2-3],GSH-PX与CAT的含量能够反映出机体的抗氧化能力。心肌血管内皮损伤贯穿于缺血再灌注损伤的全过程，缩血管物质ET-1含量增高，促进血管收缩，心肌缺血进一步加重，内皮细胞屏障被破坏，中性粒细胞大量浸润，MPO反映机体内中性粒细胞的活动程度。NF-κB是细胞核内重要的转录调节因子，与机体炎症损伤修复、细胞凋亡相关基因的表达密切相关。在炎症因子的刺激下，NF-κB通常依赖经典信号途径被活化[4]，NF-κB的活化可通过Iκκ蛋白调节，主要为Iκκβ[5-6]。

双参通脉颗粒(GSG)由人参、丹参、黄芪、麦冬、川芎、当归组成，具有益气养阴、活血通络的功效[7-8]。现代药理研究证实，人参皂苷对心血管系统具有明显的保护作用，可以抑制细胞凋亡，扩张血管等，其作用机制可涉及多个细胞信号传导通路[9]。丹参提取物具有抗血小板凝聚、降低血液黏度、调节凝血系统的功能，是一种安全可靠的治疗心脏血管疾病的天然中药[10]。黄芪注射液有调节机体免疫状态的功能,常用于治疗心力衰竭、心率失常和冠心病。黄芪皂苷可通过抑制心肌细胞膜Na+-K+-ATP酶增强心肌收缩力,改善心室构型、射血功能和心肌营养,降低心肌耗氧量,并可稳定细胞膜从而减轻心肌细胞的损伤[11]。麦冬多糖具有抗心肌细胞损伤的功效，能促进血管新生，从而发挥抗心肌缺血作用[12-13]，麦冬抗心肌缺血和心肌梗死的作用可能与保护心肌的 SOD 活性、防止心肌细胞脂质过氧化及改善脂肪酸代谢有关[14]。麦冬总皂苷对心肌细胞缺氧再灌注损伤具有保护作用[15]。川芎的有效成分挥发油、酚酸及有机酸、生物碱、三萜类化合物等都可以有效地扩张心脑血管，增加血流量，预防冠脉及主动脉痉挛、镇静镇痛，抑制血小板聚集、肝脏纤维增生、氧自由基释放，解除平滑肌痉挛等[16]。川芎嗪可以通过抑制NF-κB信号通路，改善由血管紧张素 II(Ang II) 介导的新生小鼠心肌细胞肥大[17]。在大鼠血栓模型实验中，当归提取液高剂量 (80 mg/kg) 条件下对血栓的形成有拮抗作用，阿魏酸及多种氨基酸具有抗心律失常、扩张血管、减少细胞凋亡等多种药理作用[18-20]。综上，随着中医药现代药理研究的不断深入，中药的临床应用价值越来越被人们所重视。中医学认为，气能生血行血，方中6味药经合理配伍，通过益气活血的功效，改善心肌缺血，缓解心肌组织氧化损伤。

本实验证实，GSG组ET、MPO浓度明显减少，表明GSG能有效降低心肌ET、MPO浓度，减轻心肌缺血再灌注损伤。GSG组心肌组织NF-κB、Iκκβ蛋白表达明显降低，表明GSG可能通过调节NF-κB、Iκκβ抑制心肌细胞凋亡。细胞凋亡是MIRI的重要损伤因素，本实验表明GSG能减轻心肌炎症反应，降低心肌细胞凋亡，减轻氧化损伤，其机制可能与降低ET、MPO，升高GSH-PX、CAT，抑制NF-κB、Iκκβ蛋白表达有关。