引经药柴胡配伍大黄-丹参药对抗大鼠肝纤维化作用的研究*

葛文静，王慧森，刘 明，魏 征，梁瑞峰，李更生

(河南省中医药研究院，郑州 450004)

肝纤维化是由不同病因引起的肝内结缔组织的异常增生，临床通过治疗可逆转和改善肝纤维化。然而如果肝纤维化持续加重发展为肝硬化，则不可逆转，因此积极治疗和逆转纤维化是阻止肝脏疾病加重的关键。中药的成分具有多样性，其靶点也表现为多元化，在肝纤维化的治疗方面成为研究热点[1-3]。中医治疗过程中，通过引经药的应用，可提高君药及其有效成分的靶向性，从而影响疗效。文献报道显示，大黄、丹参均有抗纤维化的作用，因此本课题选用大黄、丹参作为药物对照组，配伍足厥阴肝经引经药柴胡，观察柴胡对大黄-丹参药对抗肝纤维化的增效作用。

1 材料

1.1 药物与试剂

大黄、丹参、柴胡购自河南顺康医药有限责任公司；Masson染色、碱性磷酸酶(ALP)、丙氨酸氨基转移酶(ALT)、羟脯胺酸(HYP)、天门冬氨酸氨基转移酶(AST)等试剂盒均购自南京建成生物工程研究所；转化生长因子-β1(TGF-β1)一抗购自武汉博士德生物工程有限公司；层黏连蛋白(LN)、透明质酸(HA)、Ⅲ型前胶原(PCⅢ)等试剂盒购自武汉华美生物工程有限公司；免疫组化试剂盒购自北京中杉金桥生物技术有限公司。

1.2 仪器

冷冻离心机2K15型(德国Sigma公司)；酶标仪Synergy NEO型(美国Bio-Tek公司)；显微镜CX31型(奥林巴斯公司)。

2 方法

2.1 药物制备

大黄-丹参药对提取液和柴胡提取液根据文献中方法[4]，用70%乙醇加热回流提取，并分别调整药物浓度为含生药1.0 g·mL-1和0.3 g·mL-1。

2.2 模型复制与给药

实验分为空白组、模型组、大黄-丹参药对组(简称药对组)、药对+柴胡低、中、高剂量组。购买雄性SD大鼠，180～200 g，每组10只按体质量进行随机分组。参考文献中[5-6]方法造模，大鼠按2 mL·kg-1的量注射30%CCl4橄榄油溶液至腹腔，每周2次，共7周。从注射造模的第3周分别开始灌胃给药，大黄-丹参药对组(5.0 g·kg-1)、药对+柴胡低剂量组(5.0 g·kg-1+0.75 g·kg-1)、药对+柴胡中剂量组(5.0 g·kg-1+1.5 g·kg-1)和药对+柴胡高剂量组(5.0 g·kg-1+3.0 g·kg-1)，每天1次，连续给药6周。末次给药后用10%水合氯醛麻醉，收集血清及肝脏。血清-20 ℃分装保存，肝脏分为两部分，分别用10%中性甲醛固定和-80 ℃保存。

2.3 肝组织形态的观察

肝组织固定、包埋、切片、HE染色后观察其病理学改变， 通过Masson染色法对肝组织中胶原纤维进行染色及分析。按照参考文献中王晶晶等[7]肝纤维化评估标准对大鼠肝纤维化程度进行评估。

2.4 肝脏功能和纤维化标志物检测

根据微板法试剂盒说明书按步骤进行操作，检测血清中肝功相关指标及ALT、ALP、AST的活性；通过ELISA法测定血清中LN、PCⅢ和HA表达的改变，酸水解法测定肝匀浆液中HYP的含量。

2.5 肝组织中TGF-β1的表达

肝组织蜡块切片，脱蜡处理后进行抗原修复，之后对内源性过氧化氢酶进行灭活，封闭后滴加TGF-β1一抗，置于37 ℃过夜，同时滴加对应的二抗孵育20 min后进行DAB显色。采用Image-Pro Plus 6.0测定积分光密度值(integrated optical density，IOD)并进行统计。

2.6 统计学方法

3 结果

3.1 肝组织形态的改变

图1显示，空白组SD大鼠肝小叶结构显示出放射状排列，无坏死、胶原纤维增生、淋巴细胞浸润等现象发生。与空白组比较，模型组SD大鼠的肝小叶明显紊乱，肝细胞大量坏死，并伴有大片的浸润和胶原纤维增粗增厚等结构异常现象。与模型组比较，药物组SD大鼠的肝细胞排列相对整齐，坏死、浸润等结构异常现象呈现出不同程度的改善，药对+柴胡组肝小叶结构改善更明显。

注：A. 空白组；B. 模型组；C. 药对组；D. 药对+柴胡低剂量组；E. 药对+柴胡中剂量组；F. 药对+柴胡高剂量组图1 各组大鼠肝组织形态学比较(HE ×200)

图2显示，空白组SD大鼠的肝小叶结构正常，仅有少量胶原纤维沉积在汇管区附近。模型组SD大鼠的肝细胞变性、坏死、排列紊乱，肝组织中可见大量的胶原纤维形成，甚至互相连接形成纤维纵隔，将肝组织分割成完全或不完全的假小叶。药物干预后可见，药对组、药对+柴胡组肝组织中变性肝细胞和胶原纤维染色减少，结构破坏有所减轻，肝纤维化有不同程度的改善。表1显示，与药对组比较，药对+柴胡组纤维化改善更明显。

注：A. 空白组；B. 模型组；C. 药对组；D. 药对+柴胡低剂量组；E. 药对+柴胡中剂量组；F. 药对+柴胡高剂量组图2 各组大鼠肝组织形态学比较(Masson ×100)

3.2 肝脏功能指标的改变

表1 大鼠肝组织胶原纤维增生的分级

表2显示，与空白组比较，模型组SD大鼠血清中ALP、ALT和AST活性均明显升高，各药物组较模型组有所降低，而药对+柴胡组血清中ALP、ALT、AST水平较药对组降低更明显，效应更强。

3.3 肝纤维化指标的改变

表3显示，模型组大鼠血清中LN、HA、PCⅢ及肝组织匀浆液中HYP的表达较空白组显著上调。与模型组比较，各药物组LN、HA、PCⅢ和HYP的表达均有下调，药对+柴胡组降低更明显。

表2 各组大鼠血清ALT，AST和ALP活性比较

注：与空白组比较：1)P<0. 01；与模型组比较：2)P<0. 01；与药对组比较：3)P<0. 05，4)P<0. 01

表3 各组大鼠血清中LN、HA、PCⅢ和肝匀浆中HYP含量比较

注：与空白组比较：1)P<0. 01；与模型组比较：2)P<0. 01；与药对组比较：3)P<0. 05，4)P<0. 01

3.4 大鼠肝组织TGF-β1表达的改变

图3表4显示，空白组TGF-β1蛋白表达量较少。模型组切片中棕色颗粒明显增多，TGF-β1表达明显上调。与模型组比较，各给药组切片的棕色颗粒相对减少，TGF-β1表达不同程度下调，药对+柴胡组TGF-β1的表达减少更明显。

注：A. 空白组；B. 模型组；C. 药对组；D. 药对+柴胡低剂量组；E. 药对+柴胡中剂量组；F. 药对+柴胡高剂量组图3 各组大鼠肝组织中TGF-β1表达比较

4 讨论

肝纤维化是以细胞外基质(ECM)的过度沉积为特征的可逆性肝损伤，然而纤维化继续发展变成肝硬化则不可逆。因此，积极治疗和逆转纤维化是阻止肝脏疾病加重的关键。肝纤维化过程复杂、靶点繁多，单一靶点的药物并不能很好地控制病情。中药的成分复杂多样，可以从各方面、多机制共同作用，更好地对肝纤维化进行预防及治疗[2-3]。中医治疗过程中，常通过引经药的应用提高君药及其有效成分的靶向性，从而增强疗效。

表4 各组大鼠肝组织中TGF-β1表达比较

注：与空白组比较：1)P<0. 05；与模型组比较：2)P<0. 01；与药对组比较：3)P<0. 05，4)P<0. 01

本实验采用腹腔注射CC14复制大鼠肝纤维化模型，选用柴胡作为引经药，观察其对大黄-丹参药对抗肝纤维化的引经增效作用。肝脏HE染色结果显示，模型组SD大鼠的肝小叶明显紊乱，肝细胞大量坏死，并伴有大片浸润和胶原纤维的增粗增厚等结构异常现象。与模型组比较，药物组SD大鼠的肝细胞排列相对整齐，坏死、浸润等结构异常现象呈现出不同程度的改善，药对+柴胡组肝小叶结构的改善更明显。Masson染色结果进一步显示，药对+柴胡组胶原纤维沉积及肝小叶破坏较模型组改善更明显，提示柴胡作为引经药，可提高大黄-丹参的抗肝纤维化作用。

通常情况下，大量的ALT、AST、ALP及γ-GGT等代谢酶类聚集在肝细胞内。当外界因素作用于肝细胞引起肝损伤时，细胞膜的通透性增加，胞内的各种代谢酶等透过细胞膜进入血液。因此，检测血清中ALT、AST、ALP的水平，可间接反映肝功能损伤的程度[8]。而血清中的LN、HA、PCⅢ是胶原蛋白、蛋白多糖等细胞外基质的主要成分，检测血清中LN、HA、PCⅢ表达增多，提示ECM在肝脏中沉积较多，纤维化程度较严重。HYP作为胶原蛋白特有的组成成分，与肝脏纤维化的程度成正相关[7-9]。实验结果显示，药物干预后大鼠血清中ALT、AST、ALP、LN、HA、PCⅢ表达降低，肝匀浆中HYP含量减少，药对+柴胡组较药对组降低更明显。

TGF-β1因子在肝纤维化调节过程中发挥着重要作用。TGF-β1通过激活肝星状细胞(HSC)促进胶原蛋白、蛋白多糖、纤维连接蛋白等合成，形成ECM并大量沉积。同时，TGF-β1通过促进HSC分泌MMP抑制剂，减少ECM的降解。ECM的合成与降解失去平衡，从而加速肝纤维化的发展[10-12]。本实验结果显示，与模型组比较，各给药组大鼠肝脏中TGF-β1表达下调，药对+柴胡组下调更明显，提示大黄-丹参药对作用于CCl4所致的肝纤维化大鼠具有保护作用，其机制可能与下调TGF-β1的蛋白表达，从而减少基质胶原的合成与沉积有关。而柴胡作为引经药可增强大黄-丹参药对抗肝纤维化的作用，在治疗肝纤维化时具有引经增效作用。

综上所述，大黄-丹参药对能明显改善SD大鼠的肝纤维化程度，柴胡作为引经药可增强其疗效，其机制可能与下调TGF-β1蛋白的表达，从而减少基质胶原的合成与沉积有关，有待进一步深入研究。