益艾康治疗对HIV-1感染者CCR5、CXCR4表达及T细胞活化水平的影响*

刘 真，李 强，邓博文，李承乘，李 杰，桑 锋，王丹妮，徐立然

(河南中医药大学第一附属医院艾滋病临床研究中心，河南省病毒性疾病中医药防治重点实验室，郑州 450000)

HIV感染人体需要病毒与靶细胞表面CD4受体及辅助受体相互作用，HIV-1病毒株进入细胞的辅助受体主要为CCR5和CXCR4两种[1]，目前基于HIV/AIDS感染后CD4+、CD8+T细胞表面CCR5和CXCR4的表达情况研究报道较多，但学者们并未取得统一性结论[2-3]。艾滋病病毒感染机体后会引起一系列的免疫反应，研究已表明人类白细胞抗原(HLA)分子介导的细胞毒性T淋巴细胞反应(CTL)对控制病毒的复制具有重要作用，白细胞分化抗原(CD38)和人类白细胞Ⅱ类抗原(HLA-DR)是反映细胞激活状态的跨膜分子[4]。益艾康胶囊是治疗艾滋病的临床经验方，已在国家中医药管理局艾滋病救治项目(河南)中推广使用。临床研究表明，该制剂在临床推广中显著提高艾滋病患者的免疫力[5-6]。我们在前期的研究论文中报道了我国HIV-1感染者外周血CD8+T淋巴细胞表面激活分子CD38和HLA-DR表达水平升高[7]，而HIV感染后辅助受体表达与T细胞活化水平关系等方面的报道少见，尤其罕见中药治疗对细胞活化水平和辅助受体表达的研究。本研究分析了HIV感染者外周血CD8+T淋巴细胞表面CD38和HLA-DR表达水平与辅助受体表达关系，探讨益艾康治疗对艾滋病病毒感染引起免疫损伤的修复作用。

1 材料与方法

1.1 临床资料

65例HIV-1阳性标本来源于河南中医药大学第一附属医院艾滋病门诊收治的病人，均经Elisa初筛和Western blot确诊为HIV-1感染者，诊断均符合2011版本的《艾滋病诊疗指南》[8]。其中男34例，女31例，年龄16～45岁；健康对照人群10例，全部来自河南中医学院第一附属医院健康体检者，与HIV感染人群在性别和年龄上均衡可比。65例感染者中11例未接受治疗，其余54例为益艾康治疗组。益艾康主要药物组成：人参、黄芪、炒白术、茯苓、当归、川芎、白芍、黄芩等，具有健脾益气、养血解毒的功效。服用方法为每日3次，每次5粒，疗程6个月以上。所有样品均在受试对象知情同意的情况下采集抗凝全血。

1.2 CD4+T淋巴细胞绝对计数检测

已标记好的Trucount管中加入20 μL 抗- FITC-CD3、抗-PE-CD4、抗-PerCP-CD45、抗- APC-CD8混合抗体(BD公司)，后加入50 μL充分混匀的全血振荡混匀，室温避光20 min。然后加入450 μL 1 × FACS裂解液，立即振荡混匀，室温避光裂解10 min至溶液澄清。利用FACS Calibur流式细胞仪进行检测，采用MultiSet软件收集细胞并同时进行分析，得到淋巴细胞亚群相对及绝对计数。

1.3 血浆病毒载量测定

采用COBAS AMPLICOR HIV-1定量检测试剂盒(Roche公司)在COBAS AMPLICOR全自动PCR检测仪上定量测定感染者血浆中HIV-1 RNA含量，病毒载量检测下限为20 copies/ml。

1.4 CD8+T淋巴细胞表面辅助受体CCR5、CXCR4表达水平的测定

取100 μL EDTA抗凝新鲜外周血，加入10 μL FITC-CD8 Ab(BD)、5 μL PE-CXCR4 Ab(BD)、5 μL APC-CCR5 Ab(BD)，混匀后室温避光标记20 min，然后加入2 ml溶血素，立即振荡混匀，室温避光10 min至溶液澄清，1500 r/min离心10 min，除去未结合的荧光抗体后洗涤细胞(2 ml PBS，1500 r/min离心10 min)，将染色好的细胞重悬于300 μL的PBS中，用BD CantoⅡ流式细胞仪获取数据，Flowjo软件分析CCR5+/CD8+、CXCR4+/CD8+表达水平。

1.5 CD8+T淋巴细胞表面CD38和HLA-DR表达水平的测定

取100 μL EDTA抗凝新鲜外周血，加入10 μL FITC-CD8 Ab(BD)、10 μL PerCP-HLA-DR Ab(BD)、2.5 μL APC-CD38 Ab(BD)，混匀后室温避光标记15 min，加入2 ml溶血素立即振荡混匀，室温避光10 min至溶液澄清，1500 r/min离心10 min，除去未结合的荧光抗体，加入2 ml PBS溶液洗涤细胞，将标记细胞重悬于300 μL的PBS中，用BD Calibur流式细胞仪获取数据，Flowjo软件分析CD38+/CD8+、HLA-DR+/CD8+百分比表达。

1.6 统计学方法

统计学分析及作图采用Excel 2007、SPSS 16、GraphPad Prism 5完成，采用Mann-Whitney U检验比较2组间病毒载量水平差异,多组间比较采用方差分析，相关性分析采用Pearson直线相关或Spearman秩相关分析，P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 CD8+T细胞表面辅助受体表达及细胞活化水平流式图例

图1、2显示，利用多色流式细胞表面染色技术检测CD8+T细胞表面辅助受体(CXCR4/CCR5)及细胞活化水平(HLA-DR/CD38)，健康对照组、HIV未治疗组、益艾康治疗组3组典型流式图例。

图1 健康对照组、HIV未治疗组、益艾康治疗组CD8+T细胞表面辅助受体表达流式典型图例

图2 健康对照组、HIV未治疗组、益艾康治疗组CD8+T细胞活化水平流式典型图例

2.2 HIV感染者辅助受体表达与T细胞活化水平相关性研究

图3显示，相较健康人群，HIV感染者CD8+T细胞表面CCR5表达升高，CXCR4表达降低。为探讨辅助受体的表达是否与细胞活化水平相关，本研究分析了感染者体内CCR5+/CD8+、CXCR4+/CD8+表达水平与CD38+/CD8+、HLA-DR+/CD8+的关系。结果显示，CCR5+/CD8+表达与CD38+/CD8+、HLA-DR+/CD8+成正相关，CXCR4+/CD8+表达与CD38+/CD8+、HLA-DR+/CD8+成负相关。

2.3 益艾康治疗对HIV感染者辅助受体和T细胞活化水平的影响

图4表1显示，为揭示益艾康对辅助受体及T细胞活化水平的影响，本研究比较分析了健康对照组、未治疗组、益艾康治疗组CD8+T细胞表面CCR5、CXCR4、CD38及HLA-DR表达水平，同时分析了不同组别间CD4绝对计数和血浆病毒载量水平。结果显示，未治疗组和益艾康治疗组CCR5、CD38及HLA-DR表达高于健康对照，健康人群CXCR4表达高于未治疗组和益艾康治疗组。健康对照组、未治疗组、益艾康治疗组CD4 count分别为711、402、476 cells/μL；3组CD38+/CD8+百分比分别为59.76%、80.33%、74.43%；HLA-DR+/CD8+百分比分别为47.51%、68.94%、61.07%；CCR5+/CD8+百分比分别为51.75%、59.41%、56.33%；CXCR4+/CD8+百分比分别为66.48%、43.54%、51.67%。CD4、CXCR4、CD38及HLA-DR的表达在3组之间比较差异有统计学意义。研究结果显示，益艾康治疗组CD4绝对计数和血浆病毒载量水平优于未治疗组，益艾康治疗可部分恢复辅助受体的表达水平，相较未治疗组益艾康治疗可使T细胞活化水平接近于正常对照组。

3 讨论

趋化因子是属于细胞因子超家族的一类小分子物质，主要由白细胞分泌通过与靶细胞膜上相应的受体结合而发挥生物学作用，主要功能是通过受体介导而引起粒细胞、单核/巨噬嗜细胞及淋巴细胞的趋化作用迁移和活化，调节造血祖细胞的增殖，趋化因子及其受体在免疫反应、器官发育、肿瘤形成等诸多病理及生理过程中发挥重要作用。趋化因子受体是一类表达于多种细胞表面且能与趋化因子结合的细胞表面蛋白，是具有7次跨膜结构的G蛋白偶联受体。自1981年美国首次报道艾滋病以来，人们不断研究其发病机理、病程变化及防治方法，有关趋化因子及其受体与艾滋病的关系日益受到重视。HIV-1感染人体除通过结合T细胞表面的CD4分子外，还需与辅助受体相结合。与HIV感染密切相关的辅助受体主要为趋化因子受体CCR5和CXCR4[9-10]，由于辅助受体在HIV感染及致病过程中的关键作用，它们自然成为人们寻找防治艾滋病的重要突破口。

图3 HIV-1感染者CCR5/CXCR4表达与CD8+T淋巴细胞活化水平(CD38、HLA-DR)的相关性

图4 健康对照、HIV未治疗组、益艾康治疗组CD8+T细胞CCR5、CXCR4、CD38、HLA-DR表达比较

组 别例数CD4 count(cells/μL)LogVL(copies/ml)CD38+/CD8+ (%)HLA-DR+/CD8+ (%)CCR5+/CD8+ (%)CXCR4+/CD8+ (%)健康对照组10711±259▲/59.76±10.02▲47.51±17.92▲51.75±13.0966.48±11.62▲未治疗组11402±286#4.26(4.08,4.66)80.33±6.37#68.94±10.36#59.41±9.8643.54±9.29#益艾康治疗组54476±194#3.99(1.30,4.58)74.43±6.30#▲61.07±15.54#56.33±11.6351.67±10.86#▲F/t值—4.458-0.54625.7866.0320.2618.195P值—0.0270.587<0.0010.0040.7710.001

注： 与健康对照组比较:#P<0.05；与未治疗组比较:▲P<0.05

免疫激活包括细胞活化、增殖、凋亡、细胞因子分泌等一系列过程，多种指标均可用来反映免疫激活水平，CD38和HLA-DR表达常用来代表T细胞活化水平，研究表明HLA-DR和(或)CD38双(单)阳性的细胞比例对于HIV疾病进展具有重要的预测作用[11-12]。本课题组在以往的研究中发现，HIV感染者外周血CD8+T淋巴细胞表面CD38和HLA-DR的表达比例显著增高；CD4绝对计数结合CD8+T淋巴细胞的活化水平可以更全面地反映HIV感染者免疫功能受损的程度[7]。

益艾康胶囊主要药物由人参、黄芪、炒白术、茯苓、当归、川芎、白芍、黄芩等组成，具有健脾益气、养血解毒的功效，适合脾气亏虚型HIV/AIDS患者的治疗。经过10余年的临床应用及国家“十一五”科技重大专项“无症状HIV感染者中医药早期干预研究”初步证实，益艾康胶囊具有改善HIV/AIDS患者临床症状、体征，提高生存质量，减少HIV/AIDS患者机会性感染发生频次，稳定或提高患者CD4+T淋巴细胞计数，稳定患者病毒载量，对部分患者病毒载量有一定的降低作用[5-6]。益艾康治疗HIV的具体作用机制不明确。有研究表明，益艾康胶囊可在一定程度上降低HIV感染者体内调控蛋白基因表达水平，升高Th1细胞百分比。体外实验发现，益艾康含药血清能显著促进NK-92MI细胞增殖和细胞杀伤功能[13]。抗病毒疗法在艾滋病患者治疗中所出现的不良反应多、药物价格昂贵、患者依从性差；相反，中药不仅具有抗HIV病毒作用，还可提高人体免疫功能，其作用平和而持久、毒副作用小。因此，应用或联合应用中医药救治艾滋病患者已成为我国艾滋病防治工作的重要内容。

HIV感染后CD4+、CD8+T细胞表面CCR5和CXCR4表达情况的研究报道较多，较为统一的研究结果提示，HIV感染后T细胞表面CCR5的表达升高，CXCR4表达水平降低。本研究结果表明，相较HIV未治疗人群，益艾康胶囊能在一定程度上提高患者CD4水平，同时降低其血浆病毒载量水平。HIV-1感染后T细胞表面CCR5和CXCR4的表达情况与疾病进展和机体免疫反应密切相关，益艾康治疗能在一定程度上恢复CD8+T细胞表面CCR5和CXCR4的表达。HIV感染导致辅助受体表达水平变化的确切机制目前尚不明确，有研究者认为辅助受体变化可能与HIV感染后引起机体应激性异常免疫反应有关。在HIV感染中，淋巴细胞表面CD38和HLA-DR表达上升，活化明显增高，第二受体CCR5主要表达在活化的淋巴细胞表面，而CXCR4则主要表达在静息细胞表面，相应导致辅助受体CCR5表达增高，CXCR4表达降低[14]。本研究基于CD8+T淋巴细胞表面辅助受体(CCR5、CXCR4)与细胞活化水平(CD38和HLA-DR)关联性分析，初步探讨了辅助受体表达与T细胞活化水平的关系。结果显示，CD8+T细胞表面辅助受体CCR5表达与细胞活化水平成正相关，CXCR4表达与细胞活化水平成负相关。与未治疗人群比较，益艾康治疗可在一定程度上恢复感染者T细胞辅助受体及活化水平，改善艾滋病病毒感染后的免疫损伤。

综上，随着疾病进展，HIV感染者CD8+T淋巴细胞活化水平及辅助受体的表达出现明显变化，细胞活化水平与辅助受体表达的确切因果关系及其明确机制还有待进一步的研究。益艾康治疗可部分恢复辅助受体和细胞活化水平的变化，改善病人的免疫损伤，这为益艾康的作用机制研究提供了思路。