雌孕激素对宫颈腺癌Hela细胞影响的实验研究

涂开家 罗 美 陈 偲 李明梅 程晓晓 李隆玉

宫颈癌是妇女最常见的恶性肿瘤之一。大部分宫颈癌患者经手术及放化疗后，卵巢功能迅速下降甚至衰竭，体内雌激素水平骤降而出现围绝经期综合症。激素替代治疗(hormone replacement therapy,HRT)可极大改善围绝经期雌激素缺乏综合征[1-2]，能明显提高患者生活质量。由于女性生殖器官为激素的靶器官，研究认为雌激素会促进宫颈癌的发展[3]，但也有学者提出不同观点，认为雌激素能抑制宫颈腺癌细胞的增殖和分化[4]，另外，孕酮对乳腺癌有促进作用，但却可以减少和抑制子宫内膜癌的发生发展[5]，还可以减少卵巢癌的发生[6]，因此，有理由认为，宫颈作为孕激素的靶器官[7]，孕激素可能对宫颈病变甚至宫颈癌的发生发展有着重要的影响。我们用雌二醇(E2)、孕激素(P)或E2+P作用于体外培养的Hela细胞，以期观察雌、孕激素对Hela细胞的增殖、侵袭及迁移的影响。

1 材料与方法

1.1 实验细胞株

宫颈腺癌Hela细胞购自中国科学院上海细胞资源中心。

1.2 实验方法

采用免疫组化方法检测体外培养的人宫颈腺癌HeLa细胞雌、孕激素受体(Er、Pr)的表达(免疫组化判读方法：细胞核或胞质、膜出现棕黄色颗粒为阳性细胞，随机选择10个高倍视野,计数1 000个细胞,计算阳性细胞百分比,<10% 为(-),10%～30%为(+),31%～50%为(++),>50%为(+++)。

用不同浓度的E2、P和E2+P分别与HeLa细胞共培养，用CCK8检测各实验组培养后24 h、48 h及72 h Hela细胞的OD值，以观察其增殖情况。

用流氏细胞仪检测E2、P和E2+P与Hela细胞共培养48 h后细胞凋亡及细胞周期的差异。

1.3 统计学分析

2 结果

2.1 细胞株的一般特性

Hela细胞为贴壁生长细胞，呈梭形，约2～3天传代一次。

2.2 Hela细胞雌、孕激素受体Er、Pr检测

结果显示，与阳性对照乳腺癌MCF7类似，Hela细胞雌激素受体为强阳性(+++)，Hela细胞孕激素受体为强阳性(+++)。证实所购得的Hela细胞符合实验要求，进一步进行后续实验。

2.3 CCK8检测E2、P、E2+P对Hela细胞增殖影响

用不同浓度的E2、P和E2+P(0.01 μmol/L、0.1 μmol/L、1 μmol/L、10 μmol/L、100 μmol/L)培养Hela细胞24 h、48 h、72 h后，分别检测其OD值，实验结果显示各药物组浓度为10 μmol/L及100 μmol/L培养Hela细胞后OD值呈下降趋势，尤其是培养48 h后下降明显，表明其对Hela细胞生长有抑制作用，且呈现药物浓度越高，抑制作用越明显，作用时间越长，抑制越明显，而各药物组其余浓度(0.01 μmol/L、0.1 μmol/L、1 μmol/L)对Hela细胞的生长影响不明显，未观察到对Hela细胞生长的促进作用(表1)。

从CCK8细胞增殖实验结果得知，E2、P及E2+P浓度在0.01 μmol/L～1 μmol/L时对Hela细胞增殖促进或抑制作用与对照组相比无明显差异，而药物浓度为10 μmol/L及100 μmol/L两组中，前者对Hela细胞抑制率不如后者，因此，选取细胞试验中对细胞抑制率最高的100 μmol/L浓度做细胞周期和凋亡实验，细胞侵袭和迁移实验，其中E2和P的浓度均为100 μmol/L、E2+P的浓度为100 μmol/L+100 μmol/L。

2.4 E2、P及E2+P对Hela细胞凋亡及细胞周期的影响

2.4.1 E2、P、E2+P对Hela细胞凋亡的影响 实验分四组，空白对照组、E2、P及E2+P组，其中E2和P的浓度均为100 μmol/L、E2+P的浓度为100 μmol/L+100 μmol/L，结果显示与对照组相比，各实验组细胞凋亡率均增高，差异有统计学意义(图1、表2)。

表1 E2、P和E2+P组不同浓度、24、48和72 h的OD值

图1 各组Hela细胞凋亡情况

组别 凋亡率/% P对照组5.40±2.38E2组20.1±2.20<0.05P组20.03±1.91<0.05E2+P组24.40±2.40<0.05

注：P为与对照组比较。

2.4.2 E2、P、E2+P对Hela细胞周期的影响 实验结果；E2、P、E2+P组均表现为G0/G1期比例升高，S+G2/M期比例下降，与对照组相比，差异有统计学意义(P<0.05)(表3)。

2.5 E2、P、E2+P对Hela细胞迁移和侵袭的影响

2.5.1 E2、P、E2+P对Hela细胞迁移的影响 结果显示：E2组及P组Hela细胞迁移数与对照组相比差异均无统计学意义(P>0.05)，与对照组相比，E2+P组细胞迁移明显减少，差异有统计学意义(P<0.005)(表4)。

表3 空白对照组及E2、P、E2+P各组的细胞周期百分比

注：P值为与对照组比较。

表4 各组迁移细胞数比较

2.5.2 E2、P、E2+P对Hela细胞侵袭的影响 实验分组及药物浓度同上所述，与对照组相比，E2+P组侵袭细胞数明显减少，差异有统计学意义(P<0.05)(表5)。

表5 各组Hela细胞侵袭数比较

3 讨论

近年来，由于宫颈癌的筛查广泛开展，宫颈鳞癌发病率有了明显的下降，但宫颈腺癌的发病率却逐年增加，约占宫颈癌总数的20%[8]，另外，约60.3%的宫颈腺癌患者年龄小于50岁，而小于40岁的患者约57.38%[9]，这些患者中大多数经手术或放化疗后，必然因医源性绝经而出现围绝经期综合征，而解决这一问题的关键就是激素替代治疗。

目前大多数观点认为宫颈鳞状细胞癌与雌激素无关，可以行激素替代治疗，但宫颈腺癌的激素替代治疗仍存在较多争议，有学者认为一定浓度的E2(0.5～10 nmol/L)能促进宫颈腺癌Hela细胞的增殖，随着E2浓度的增加，促进作用增强，而另外一些学者观察到不同的结果，认为一定浓度的E2(20～120 nmol/L)能抑制Hela细胞的增殖[4]，并使细胞周期抑制在G2/M期，并进一步促进其凋亡。在本实验中，CCK8实验显示E2、P及二者联合在浓度为1～10 nmol/L对Hela细胞无促进作用，只有E2及P在较高浓度(10 μmol/L、100 μmol/L)时对体外培养的Hela细胞有抑制作用，且高浓度者抑制作用更强，与文献报道的结果类似[4]，可见雌激素在体外并不一定会促进宫颈腺癌Hela细胞进展；实验结果显示浓度100 μmol/L 的E2+P可降低体外培养Hela的侵袭、迁移能力，与CCK8结果及细胞周期及凋亡结果相应，进一步说明，加入孕激素在体外能抑制Hela细胞的增殖及侵袭迁移能力，目前未有文献报道，另外，已有动物实验研究证明孕激素能抑制宫颈癌的发生发展[10]，因此，宫颈腺癌患者激素替代治疗并非完全不能实施，诚然，临床宫颈腺癌激素替代治疗仍需在动物实验及不同的实验药物浓度方面进一步探索具体的可行方案。