核移植胚胎干细胞的制备、特性和应用概述

征月良

(临沂大学生命科学学院 临沂 276000)

近年来，核移植技术发展迅速，已经利用此技术获得了多种克隆动物。核移植后，从克隆胚胎中分离、培育而成的干细胞称为核移植胚胎干细胞(nuclear transfer embryonic stem cells，NTESC)，这种细胞对于胚胎嵌合研究和细胞治疗研究均具有重要的意义。本文概述NTESC的制备、特性和应用。

1 NTESC的制备

小鼠的NTESC来自克隆胚胎。将小鼠成纤维细胞核或卵丘细胞核移入去核卵母细胞，并在核移植胚胎发育至囊胚时除去囊胚的透明带，放在含有饲养层细胞的培养皿中培养就可获得NTESC，接着便可以使用胰酶消化法对NTESC进行传代。核移植后，从克隆胚胎中制备第1个NTESC系。用第1个NTESC系作为核供体细胞，进行第2次核移植，获得第2个NTESC系。以此方法可制备多个NTESC系[1]。核移植后，克隆胚胎可以发育至囊胚，但是大部分胚胎不能建立正常的胎盘组织，导致胎儿发育异常或停止，这可能是由某些基因组重编程错误所引起。重编程错误会影响囊胚滋养层的功能，滋养层功能下降不利于正常胎盘的形成，影响克隆胚胎的植入和发育。但是，研究发现只要克隆囊胚中存在功能正常的内细胞团细胞，就可以用这部分细胞制备NTESC[2]。在克隆胚胎中，常出现一些表观遗传错误，导致胎盘发育失败，而NTESC的获得不需要胎盘，甚至可从注定要死亡的胚胎中制备NTESC，这是NTESC相对于胚胎干细胞的一大优势[1]。

小鼠NTESC的制备方法基本上适用于人NTESC的培育，但需对卵母细胞去核、融合、激活方案进行优化： 在人卵母细胞去核过程中，卵母细胞需用咖啡因处理，以防止过早活化；用作核供体细胞的人成纤维细胞需先用灭活血凝病毒处理，然后放到去核卵母细胞的卵周隙中，使其与卵母细胞融合，获得成纤维细胞和去核卵母细胞的重构体；对重构体需先用电脉冲进行激活，然后培养于含有二甲基氨基嘌呤的培养液中，获得克隆胚胎，克隆胚胎发育成囊胚，便可以用来制备人的NTESC[3]。

用小鼠成纤维细胞或卵丘细胞进行核移植，均能得到有正常核型、呈现碱性磷酸酶活性的小鼠NTESC[1]。NTESC既可由同种核移植胚胎获得，也可用异种核移植胚胎制备。将人成纤维细胞与去核兔卵母细胞融合后培育成异种克隆胚胎，进一步培育就可以获得人—兔异种NTESC。

2 NTESC的特性

2.1 表达阶段特异性胚胎抗原和肿瘤排斥抗原 NTESC在体外培养时，能形成类胚体。在类胚体的外部细胞中会出现三类特异性蛋白的表达： ①巢蛋白和烯醇酶等外胚层细胞标志；②肌血红素、平滑肌肌动蛋白以及血管内皮生长因子受体等中胚层细胞标志；③甲胎蛋白和抗胰蛋白酶等内胚层细胞标志[4]。

2.2 具有分化能力 将小鼠NTESC注射到小鼠的腹膜中，形成的畸胎瘤含有三个胚层，可分别分化成神经元、肠上皮、软骨及脂肪组织[5]。用来制备NTESC的小鼠克隆胚胎通常具有发育成后代的潜能，但小鼠孤雌胚胎不能发育成后代。这种孤雌胚胎可用来获得孤雌胚胎干细胞，并将其作为核供体进行核移植，制备孤雌NTESC，所得孤雌NTESC也可分化成神经元和中胚层细胞。例如，将孤雌NTESC注入小鼠受精囊胚，可产生嵌合体小鼠，在嵌合体小鼠的大脑、肝脏、肾脏、心脏、肠及皮肤中，由孤雌NTESC分化来的细胞比例为2%～8%[6]。

2.3 表现线粒体的异质性 研究表明，人—兔异种NTESC表现人和兔线粒体DNA(mitochondrial DNA，mtDNA)共存的现象[4]。用人成纤维细胞与去核人卵母细胞进行融合，并对卵母细胞去核、融合、激活方案进行优化，可获得人NTESC。这种人NTESC的核基因组来自核供体细胞，而绝大多数mtDNA来自卵母细胞，也就是说人NTESC具有线粒体的异质性。这一现象是由于核供体细胞和去核卵母细胞融合过程中，供体细胞mtDNA一同转移进克隆胚胎的缘故[3]。

3 NTESC的应用

3.1 用于胚胎嵌合研究 NTESC能无限增殖，又具有分化的潜能，这些特性使NTESC在胚胎嵌合研究上有重要应用。将小鼠NTESC注入二倍体囊胚的囊胚腔中，可得到嵌合体小鼠。后代小鼠的细胞来自NTESC和宿主二倍体囊胚。将小鼠NTESC注入四倍体囊胚中，也能得到小鼠后代，但这种后代的细胞来自NTESC[7]。NTESC既可用正常小鼠来制备，也可由突变小鼠来获得。雌雄同体不育性突变小鼠有精巢和卵巢，具有一条异常Y染色体，不能形成生殖细胞，因而是不育的。这种不育性突变小鼠对于发育生物学的研究具有重要意义，但通过核移植方法对这种小鼠进行克隆难以成功。若先用这种小鼠的尾尖细胞进行核移植，从克隆囊胚中获得NTESC，再用NTESC进行核移植，也不能产生克隆后代。如果将NTESC注入二倍体受精囊胚，可得到嵌合体后代。在嵌合体小鼠中，来自NTESC的精子生发细胞能产生含X染色体的精子，受精后产生雌性后代，但精子生发细胞不能将异常Y染色体传递到下一代中，因此不能产生雄性不育小鼠。若通过四倍体胚胎嵌合的方法，将NTESC注入四倍体囊胚的囊胚腔中，可产生来自NTESC的后代，它们有异常Y染色体，不能产生生殖细胞，是不育的[8]。

3.2 用于细胞植入法疾病治疗研究 NTESC能分化成其他类型的细胞，从而用于细胞治疗研究。将源自小鼠成纤维细胞的NTESC植入患糖尿病的小鼠后，NTESC能分化成胰腺β细胞，能对葡萄糖刺激发生反应，释放胰岛素，从而使患病小鼠的血糖水平恢复正常[5]。用自然杀伤T细胞作核供体进行核移植，得到的NTESC能分化成NKT细胞。将这些NKT细胞注射进小鼠中，这些细胞在小鼠体内产生的干扰素γ能抑制接种的肿瘤细胞生长[9]。

4 结语

用患者自身的细胞进行核移植，可从后续工作中获得克隆胚胎，并从克隆胚胎中制备患者自身的NTESC。这种自身NTESC分化产生的功能细胞在核基因型上等同于供体细胞(即患者自身的细胞)，移植后可大大减少免疫排斥反应，从而为移植医学的研究开辟了一条重要途径。对于患有线粒体疾病的人来说，可用其体细胞进行核移植，来获得其自身的NTESC进行细胞移植治疗。尽管患者的mtDNA存在异常，但移植用NTESC中绝大多数mtDNA来自卵母细胞，用这样的NTESC进行细胞治疗，为挽救因mtDNA突变引起的细胞代谢功能异常的患者提供了一种新的方法。但是，需要特别指出，为了制备人NTESC需要获得捐赠人卵母细胞时，要严格履行知情同意原则，而且在获得克隆胚胎后，更要严格防止将用于制备NTESC的胚胎用于克隆人。另外，NTESC应用于移植治疗的安全性也需要进一步研究。