油茶炭疽病病原菌的分离与鉴定

刘小玉，余凤玉，付登强，杨伟波，贾效成，陈良秋

（中国热带农业科学院椰子研究所/油茶研究中心，海南文昌571339）

油茶为我国所特有，与油橄榄、油棕、椰子并称为世界四大木本油料树种，在我国已有2300多年的栽培历史。它适应性广，主要生长在南方，以湖南、江西、广西、海南等地为主。油茶炭疽病在我国油茶产区普遍发生，常引起严重落果、落蕾、落叶、枯枝，甚至整株衰亡[1]。病害落果率通常在20%～40%，严重时达60%以上。晚期病果虽可采收，但种子含油量仅为健康种子的一半，损失严重[2]。加强对油茶炭疽病的研究力度，提高油茶炭疽病的诊断和防治技术，是油茶生产的当务之急。因此，本文通过组织分离法对油茶炭疽病的病原菌进行分离、培养及致病性检测，并通过形态学和序列分析的方法进行鉴定，旨在明确其种类，为防治该病菌奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材料与培养基

1.1.1 试验材料

采于中国热带农业科学院油茶研究中心油茶种质资源圃的感染炭疽病的病油茶叶片。

1.1.2 PDA培养基

去皮马铃薯200 g、葡萄糖20 g、琼脂20 g。

1.2 方法

1.2.1 病原菌的分离

采用常规组织分离法分离病原菌[3]。切取病健交界处小块病变组织（5 mm×5 mm），经70%乙醇消毒30 s，再用0.1%升汞浸泡1 min，后用无菌水漂洗3次，晾干移至PDA平板培养基上，置于25℃恒温培养箱中黑暗培养。待长出菌丝后挑取菌落边缘菌丝接种至新PDA平板上进行纯化，再转接到试管斜面上培养4 d，放入4℃冰箱保存。

1.2.2 致病性检测

按照柯赫氏法则进行致病性检测。从分离病原菌的油茶植株上，选取健康嫩叶，用自来水冲洗干净，2%次氯酸钠表面消毒2 min，然后无菌水清洗3次，无菌滤纸吸干表面水分，放置于无菌高湿的培养皿中。将纯化保存的病原菌活化，接种至PDA培养基上，25℃黑暗条件下培养3～5 d，用无菌打孔器在菌落边缘切取5 mm的菌丝块，放置于培养皿中的油茶叶片洞口处。设空白PDA培养基为对照，重复3次。盖上盖子，放置于25℃恒温培养箱培养，3 d后观察发病情况。发病后从病斑上再分离病原菌，检测是否与接种菌株相同。

1.2.3 病原菌形态学观察

将纯化后的病原菌接种到PDA培养基平板上，在25℃恒温培养箱中黑暗培养，定期观察记录菌落形态学特征，并对病原菌分生孢子和厚垣孢子进行显微形态观测。

1.2.4 DNA提取、PCR扩增及序列测定

将分离菌株在PDA培养基上培养5～7 d后，收集新鲜的湿菌体0.1～0.3 g，用液氮在研钵中磨碎，装入1.5 mL的离心管中，然后用基因组DNA快速提取试剂盒（真菌）提取DNA。

PCR扩增所用引物为ITS区通用引物ITS1和ITS4。PCR反应总体积为25 μL，包括10×PCR buffer（含Mg2+）2.5 μL，ITS1 和 ITS4 各 1 μL，dNTP Mix 0.5 μL，Taq DNA polymerase 0.5 μL，模板 DNA 2 μL，ddH2O 17.5 μL。PCR 反应程序为：95℃预变性 3 min；95℃变性 30 s，55 ℃复性 30 s，72 ℃延伸 2 min，35个循环；最后72℃延伸10 min。取5 μLPCR产物用1%的琼脂糖凝胶进行电泳检测，在紫外灯下观察、并拍照保存。将PCR产物送至北京六合华大基因科技股份有限公司进行测序。将该序列通过Blast程序与GenBank中核酸数据进行比对分析，采用BioEdit、Mega5.0等软件对菌株进行系统发育分析。

2 结果与分析

2.1 油茶炭疽病症状

油茶叶片感染胶孢炭疽病菌后，病斑多从叶缘或叶尖处发生，呈半圆形或不规则形，黑褐色，具水渍状轮纹，边缘紫红色。老病斑中心灰白色，内有轮生小黑点，使病斑呈波纹状，如图1所示。

图1 油茶炭疽病病症Fig.1 Anthracnose disease of Camellia oleifera

2.2 致病性测定结果

致病性检测发现菌株7-2能引起健康油茶叶片发病，对照组未见发病。第4 d起已出现褐色病斑，随后病斑上产生白色菌丝。随着时间推移，病斑逐渐扩大，乃至蔓延到整个叶片。从这些病斑上再次分离病原菌，发现所获得的分离物与接种菌一致，表明所分离的菌株为引起油茶炭疽病的病原菌。

2.3 病原菌的分离结果与形态特征

采用常规组织块法分离得到菌株，编号为7-2，保存于中国热带农业科学院油茶研究中心。菌株7-2在PDA培养基上培养后，菌落为圆形并呈等径辐射生长，无褶皱，边缘整齐，菌丝初期为白色，后逐渐变为灰黑色，气生菌丝生长旺盛，由白色变成灰白色，再渐变为深灰色絮状（见图2）。分生孢子单孢，无色，圆柱形或圆筒形，两头钝圆，中间略凹，两端不对称，大小为(5.18～8.29)μm×(9.47～19.37)μm。这些形态特征与胶孢炭疽菌形态特征相符[4,5]。因此，初步确认菌株7-2为胶孢炭疽菌（Colletotrichum gloeosporioides）。

图2 胶孢炭疽菌病原菌菌落Fig.2 Pathogenic bacteriacolony of Colletotrichum gloeosporioides

2.4 病原菌基因序列分析

经rDNA ITS1和ITS4引物对菌株7-2进行PCR扩增，获得一条长度为577 bp大小的片段。将该序列与GenBank中核酸数据库（http://ncbi.nlm.nih.gov/blast）进行同源性比较，发现菌株7-2序列与GenBank（序列登录号：MH265979.1、MF800896.1）库中登录的胶孢炭疽菌的序列完全一致，同源性为100%，因此可以确定菌株7-2为胶孢炭疽菌。

3 结论

本研究通过形态学、分子生物学及致病性检测，证明了引起油茶炭疽病的病原菌为胶孢炭疽菌。胶孢炭疽病菌是世界上最重要的致病菌之一，至少能够侵染1000多种植物，主要危害寄主植物的叶片和果实，也可危害枝梢，引起叶斑、落叶、果实腐烂和枝梢枯死[6]。油茶果实被害初期在果皮上出现褐色小斑，逐渐扩大为黑色圆形病斑，有时数个病斑连接成不规则形，无明显边缘，后期病斑上出现轮生的小黑点。嫩叶受害时，病斑多从叶缘或叶尖处发生，呈半圆形或不规则形，黑褐色，具水渍状轮纹，边缘紫红色。老病斑中心灰白色，内有轮生小黑点，使病斑呈波纹状。枝梢受害，多发生在新梢基部，少数在梢中部，椭圆形或梭形，初为黑褐色，后变成黑色。花芽和叶芽受害变黑色或黄褐色，无明显边缘，后期呈灰白色，上生小黑点，严重时芽枯蕾落。另外，由于胶孢炭疽病菌寄主范围非常广泛，对大量的经济作物如芒果[7]、建兰[8-10]、橡胶[11]、梨、草莓和柑橘等易造成严重危害。可见准确鉴定胶孢炭疽病菌并有效防止该病害的发生、蔓延和危害，对促进我国种植业的安全生产，维护种植者利益，具有十分重要的现实意义。