急性脑梗死患者血清中miRNA-22的表达水平及临床意义

王念 戴心怡

急性脑梗死的发生率约占脑卒中的70%左右[1]，其疗效通常随着发病时间的延长而下降，治疗的临床结局通常依赖于早期诊断和快速的临床决策[2]。然而，现阶段急性脑梗死病理机制尚不完全清楚，因此急需研究急性脑梗死早期诊疗及预后评估的新型、有效的生物标志物。研究报道急性脑梗死患者血清中存在某些异常的循环miRNA[3]，参与了炎症因子的释放等多种生物学过程[4]，影响急性脑梗死的诊断和预后。本研究讨论急性脑梗死患者血清中miRNA-22的表达与预后的相关性，同时也分析其与一些关键促炎细胞因子的相关性。

1 材料与方法

1.1 一般资料纳入2016年1～12月于我院就诊的急性脑梗死患者100例作为ACI组，同时纳入50例年龄、性别相匹配的正常体检者作为对照组。收集急性脑梗死患者和对照组临床病史资料，以及既往病史如：吸烟史、饮酒史、高血压史、糖尿病史、高血脂史等资料。计算患者入院NIHSS评分和发病后第30天格拉斯哥预后(GOS)评分。所有患者在入院72h内接受脑部CT或MRI检查，诊断为急性脑梗死。急性脑梗死的诊断依照2013年美国心脏协会/美国中风协会(AHA/ASA)指南要求进行[5]。

该研究获得我院伦理委员会批准，所有参与者均签订知情同意书。入选标准如下: ①初次发病的急性脑梗死者;②急性脑梗死患者存活时间超过72h者；③经头颅CT或MRI确诊为急性脑梗死者。排除标准：①出血性脑卒中者；②短暂性脑缺血发作(TIA)者；③眩晕综合征者；④颅内肿瘤及其他部位恶性肿瘤者；⑤癫痫者；⑥近2个月内有感染发作病史者；⑦既往有自身免疫性疾病病史者；⑧血液疾病者；⑨肝肾功能不全者等。

观察指标：急性脑梗死患者和健康对照组临床资料及既往病史资料；入院24h内血清miRNA-22、CRP、IL-6、IFN-γ 及 PCT水平；入院后 NIHSS评分及发病第30天GOS评分。

1.2 研究方法

1.2.1 标本采集 清晨空腹状态下采集患者及对照者静脉血5ml，室温离心10min,收集血清并放置-80℃保存待测。

1.2.2 实时荧光定量 PCR 利用 TRIzol (Invitrogen)从血清样本中提取总RNA，并在ABI 7500实时PCR 仪器上利用 Hairpin-itTM miRNAs qPCR 定量试剂盒（中国上海吉玛制药）检测miRNA-22的相对表达量，而U6 （RNU6B，中国上海吉玛制药）则用来作为内参对照。PCR循环程序为： 95℃ 持续30s；随后 95℃持续 5s ， 60℃ 持续 30s，并连续 40个循环。引物在南京金斯瑞公司合成。

1.2.3 检测血清中细胞因子 利用酶联免疫吸附方法(ELISA)检测ACI患者和健康对照组血清中CRP、IL-6、IFN-γ及PCT的水平。严格按照C-反应蛋白检测试剂盒（免疫比浊法）、IL-6定量测定试剂盒(上转发光法)、IFN-γ检测试剂盒（胶体金法）及PCT测定试剂盒（化学发光法）及相关检测设备的操作流程。

1.3 统计学方法利用SPSS 19.0统计软件分析数据。卡方检验对定量数据进行检查，如果定量数据符合正态分布，则使用t检验或者ANOVA方法。Spearman 和Pearson分析用来检查变量之间的相关性。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 临床资料比较两组一般临床资料对比无统计学差异（P＞0.05），见表1。

表1 两组临床资料比较[n（%）]

2.2 急性脑梗死患者发病后第30天GOS评分急性脑梗死患者发病后30天GOS评分5分29例，4分55例，3分12例，2分3例，1分1例。

2.3 两组血清中miRNA-22水平表达的比较ACI组与对照组患者血清中miRNA-22的表达分别为1.89±0.23与1.01±0.11，ACI组显著上升（t=-21.72，P＜0.05）。miRNA-22 ROC曲线下面积(AUC)为0.912，95%CI 0.887～0.962，最优割点为 1.5，而切点的敏感性和特异性分别为81.46%和95.4%。

2.4 急性脑梗死患者血清miRNA-22的表达水平与患者GOS评分和NIHSS评分相关性GOS ≤3分的患者16例，GOS=4分患者55例，GOS=5分患者29例。急性脑梗死患者血清中miRNA-22的表达水平与 GOS 评分呈正相关（r=0.5954,P＜0.001）。miRNA-22与 NHISS评 分 呈 负 相 关（r=-0.6547，P＜0.0001）。

2.5 两组血清中炎症因子表达水平比较急性脑梗死患者入院24h内血清中CPR水平、IL-6水平、IFN-γ水平均较对照组表达显著增加（P＜0.05）,而PCT水平较对照组无统计学差异（P＞0.05），见表2。

表2 两组CPR、IL-6、IFN-γ及PCT表达水平

2.6 急性脑梗死患者血清中CPR 、IL-6和IFN-γ的表达与短期预后GOS评分、NIHSS评分、miRNA-22表达水平的相关性急性脑梗死患者血清中炎症细胞因子CPR、IL-6和IFN-γ的表达水平与GOS评分、NIHSS评分、miRNA-22表达水平都无相关性，见表3。

表3 急性脑梗死患者血清中CPR、IL-6、IFN-γ的表达与GOS评分、NIHSS评分、miRNA-22表达的相关性

3 讨论

急性脑梗死是临床急诊中常见的神经系统疾病之一[6]。在大多数情况下，急性脑梗死发病突然，而且脑梗死的进展很快，因此在患者入院后的几个小时内，如果没有给予合适的治疗，患者可能会错过最佳治疗时间。因此，有效的早期诊断和预测生物标志物将帮助医生制订快速的临床决策并对脑梗死的预后做出判断。

越来越多的研究发现，急性脑梗死能够诱发炎症因子的释放，导致炎症反应的发生[7]。一方面，机体功能的抑制，有利于炎症反应的发生，另一方面，炎症反应能够促使神经系统功能恶化[8]。急性脑梗死发生后，炎症因子被激活并迅速释放至大脑组织和周围血液中[9]，炎症反应进一步促进了神经细胞的凋亡[10]。急性脑梗死患者病情的严重程度和预后不仅与神经系统损伤的严重程度相关，炎症反应也是干预急性脑梗死预后的重要原因[11]。

MicroRNA作为一种神经元基因表达的重要调控因子，成为脑梗死患者一种新的早期诊断和临床预后预测的生物标志物[12]。Tian等[13]证明血浆中miR-16是超早期脑梗死的诊断和治疗的标志物；miR-29b可以作为脑梗死预后预测的生物标记物和治疗靶点[14]。

不同研究中已经发现了脑梗死患者血清中多种炎症因子的异常表达[15,16]。既往研究发现急性脑梗死患者血清中TNF-α、IFN-γ、IL-22和 IL-6等炎症因子出现异常表达[17]。一些循环miRNA的表达也与炎症反应具有相关性[18]。 Puskarich 等研究发现 miRNA-146a、miRNA-223 和 miRNA-150 的表达与感染性休克具有相关性，而且 miRNA-150的表达与感染性休克患者的死亡率相关[19]。

miRNA-22和炎症因子水平的高表达，提示miRNA-22在促进炎症反应方面可能发挥作用，本次研究发现miRNA-22与炎症因子在急性脑梗死患者血清中表达均升高，但无相关性。miRNA-22是否直接通过某些炎性信号通路作用于炎症因子的表达，有待进一步研究。

在本次研究中发现急性脑梗死患者血清中CRP、IL-6、IFN-γ表达水平上调，但与患者入院NIHSS评分和GOS评分无相关性。尽管上述促炎性因子可能并不是miRNA-22的直接靶点。但是，miRNAs和促炎细胞因子之间的正相关性提示miRNA-22表达的异常上升导致某些炎性信号通路中的关键信号分子的表达增加，并增加促炎细胞因子的产生。这些结果提示miRNA-22可能通过促进炎症反应进而加快急性脑梗死的发生和进展。

本研究不足之处在于病例数相对较少，同时仅有GOS评分,没有生存和死亡的临床结局。因此我们还需要进行较大规模的临床前瞻性研究，来探明miRNA-22在急性脑梗死进展及预后的作用。

综上所述，miRNA-22表达水平与患者病情严重程度及患者短期预后相关，有潜力成为一种急性脑梗死的诊断和进展预后预测的生物标志物。ACI患者血清炎症因子CRP、IL-6、IFN-γ水平在急性脑梗死早期升高，但与急性脑梗死神经系统功能缺失程度及患者预后不相关。