TLR4基因多态性及细胞因子与牙周炎、COPD的相关性分析

张晓姣 于慧 林梅 桂枫 王左敏

牙周炎（Chronic Periodontitis）是由菌斑微生物引起的感染性疾病，临床特征包括牙龈出血，牙周袋形成，进行性附着丧失和牙槽骨吸收，是我国成人失牙的主要原因之一。慢性阻塞性肺疾病(chronic obstructive pulmonary disease，COPD)是一种以持续气流受限为特征，发病机制尚不完全明了的慢性呼吸系统疾病，患病率和病死率较高。近年来，越来越多的研究表明牙周炎是COPD的一个独立危险因素。COPD患者的牙周组织炎症比非COPD患者严重，重症COPD患者的牙周程度也相对更重[1]。牙周状况恶化是肺功能快速下降的危险因素[2～4]。

Toll样受体 4（Toll-like recepotors）主要识别绝大多数革兰阴性细菌的脂多糖（lipopolsaccharides，LPS），诱导产生过多的炎性因子如白细胞介素（IL-1β、IL-6）、肿瘤坏死因子（TNF-α），引发过强炎症反应从而导致组织损伤。研究证实，TLR4 rs1927907、rs11536889基因多态性是慢性牙周炎发展的危险因素[5]。TLR4 rs1927907的牙周炎患者与健康者相比更加易感COPD[6]。本研究通过观察TLR4 rs1927907、rs11536889 基因多态性与慢性牙周炎及COPD炎性通路中炎性因子IL-1β、IL-6、TNF-α的分泌水平的相关性，为进一步阐明慢性牙周炎与COPD的共同基因易感机制提供新的思路。

1 材料与方法

1.1 研究对象2012年1月～2013年4月从首都医科大学附属北京朝阳医院招募研究对象。纳入标准：汉族；口腔内存留牙不少于15颗；受试前未接受牙周治疗；无其他慢性疾病；入选前4周无感冒、发烧及其他部位炎症性病变；近半年内未使用抗生素、免疫抑制剂。签署知情同意书。共纳入210例，男141例，女69例，年龄62.75～72.21岁，慢性牙周炎患者81例，COPD患者27例，慢性牙周炎伴COPD患者76例，健康对照者26例。见表1。

表1 各组研究对象的一般情况[n（%）]

1.2 牙周健康状况检查检查受试者口腔内所有牙齿的牙周探诊深度(probing depth，PD)，牙周附着丧失 (attachmentloss，AL)，龈沟出血指数 (sulcubleeding index，SBI)，菌斑指数 (plaque index，PLI)，松动度和骨吸收程度，所有检查均由2名牙周专业医生完成。

1.3 肺功能检测呼吸健康状况检查：根据2011年GOLD和我国COPD诊治指南（2013年修订版）[7，8]，确定肺功能是诊断COPD的金标准，通过支气管舒张剂吸入实验测定受试者第1秒用力呼气容积/用力肺活量比值(FEV1/FVC)。比值＜70%可诊断为COPD。

1.4 外周血收集和基因组DNA的提取抽取受试者前臂静脉血4ml，EDTA抗凝，于-20℃冻存。静脉血样本冰上解冻，离心后取沉淀白细胞，加10%SDS、ES和蛋白酶混匀，37℃过夜。离心后取上清，氯仿离心抽提，无水乙醇析出DNA，70%乙醇洗涤DNA后，转移到Ependoff管，晾干，加缓冲液于-80℃冻存。

1.5 基因型测定应用美国ABI公司7900HT聚合酶链反应仪，使用TaqMan MGB探针法对受试者进行基因型测定。反应体系:PCP总反应体积25μl，DNA模板 0.5μl，2.5μl TaqMan universal PCR master mix 2×（Applied Biosystems，Foster City，CA，USA），0.125μl 40×TaqMan genotyping assay mix，超纯水 1.875μl。反应条件：95℃预变性10min ，95℃变性15s，60℃退火 1min，共50个循环，然后使用SDS2.3分型软件进行基因型区分。对部分样本进行重复实验以确保分型的准确性，结果没有差别。

1.6 IL-1β、IL-6、TNF-α的检测抽取受试者前臂静脉血，分离血清，-80℃保存备用。按照ELISA试剂盒（Human IL-1βELISA Kit， Human IL-6 ELISA Kit，Human TNF-αELISA Kit，CUSABIO 公司）说明书，受试前将血清及试剂盒放置室温，采用双抗体夹心法，操作按照说明书，分别检测IL-1β、IL-6、TNF-α水平。

1.7 统计学方法采用SPSS 13.0统计软件进行统计分析。各组间基因型和等位基因的频率分布用χ2检验。方差分析法、独立样本t检验分析各组基因型与炎性因子水平关系。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 TLR4基因型和等位基因频率的分布四组中，TLR4多态性位点基因型和等位基因的频率无显著性差异（P＞0.05），见表2、3。

2.2 四组受试者血清IL-1β、IL-6、TNF-α水平检测四组受试者血清IL-1β、IL-6、TNF-α浓度如图1所示，统计分析显示健康组与其余三组炎性因子浓度之间均有显著性差异(P＜0.01)。

2.3 TLR4 rs1927907、rs11536889基因多态性与血清中IL-1β、IL-6、TNF-α水平的相关关系将受试者进一步分组，rs11536889野生型(GG)、杂合突变体和纯合突变体(GC+CC)。采用独立样本t检验，分析炎性因子水平的差异。牙周炎组，rs11536889 GG基因型患者血清中的TNF-α水平低于GC+CC基因型患者(P=0.038)。慢性牙周炎伴COPD组，rs11536889 GG基因型患者血清中的IL-6水平显著高于GC+CC基因型患者(P=0.006)。其余各组无统计学差异（P＞0.05），见图 2、3。

表2 TLR4 rs1927907基因型和等位基因频率[n（%）]

表3 TLR4 rs11536889基因型和等位基因频率[n（%）]

图1 四组人群血清IL-1β、IL-6、TNF-α浓度比较

图2 四组人群rs1927907基因型与血清IL-1β、IL-6、TNF-α浓度比较

图3 四组人群rs11536889基因型与血清IL-1β、IL-6、TNF-α浓度比较

3 讨论

遗传易感性在牙周炎和COPD的发病中均发挥着至关重要的作用，二者可能存在共同的基因易感机制。近年来对TLR单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphism，SNP)的研究越来越多，主要考虑因素是TLR SNP可能降低TLR配体的反应效能，从而影响感染性疾病的易感性[9]。主要功能 性 SNP 包括 TLR4 Asp299gly、Thr399Ile12 和rs1927907、rs11536889 等[10]。其中，TLR4 rs1927907位于内含子区。内含子区多态性可能通过选择性剪接调控基因的表达。TLR4 rs11536889位于3'端非转录区，影响mRNA的转录或稳定性，进而可能影响氨基酸合成或蛋白表达。但是多篇文献研究结果不尽相同，提示基因的分布规律与种族及地域的差异等有关。

在亚洲人群中，有学者研究发现日本人群的 TLR2、TLR4 9个基因多 态 性 位点中，TLR4 rs11536889存有显著差异，并且发现该位点的CC基因频率在中、重度牙周炎患者中较高[11]。在中国人群中，TLR4 rs11536889、rs1927907基因多态性与多种全身系统疾病相关，如2型糖尿病、牙周炎、COPD 等[5，6，12]。前期课题团队研究发现在中国汉族人群中 TLR4 rs11536889 GG 基因型频率在重度牙周炎组患者中显著高于中度牙周炎组。说明携带GG基因型的患者更易发展成为重度牙周炎。单倍型 G-C-G rs1927907-rs11536889-rs7873784 是牙周炎的危险因素之一[5]。研究团队进一步分析发现，TLR4 rs1927907位点的基因型分布及等位基因频率分布显著不同（P=0.039），CP（AA：26，8.5%，AG：109，35.5%，GG：172，56.0%）和 CP 与 COPD（AA：41，12.0%，AG：143，41.7%，GG：159，46.4%）。调整年龄、性别、吸烟状况和口腔卫生习惯后，发现TLR4 rs1927907中携带AG基因型的CP患者比携带GG基因型的患者更容易罹患COPD（P=0.005，OR=1.94， 95%CI 1.22～3.03）。综上所述，TLR4 基因多态性在CP和COPD的常见病理生理过程中发挥作用，表明携带TLR4 rs1927907基因多态性的CP患者可能更容易罹患COPD[6]。

前期研究结果是基于基因型的分析。本研究检测了多态性对细胞因子分泌的作用。本研究结果显示：四组中，没有发现TLR4 SNP基因型和等位基因的频率有显著性差异，均为P＞0.05。四组受试者血清IL-1β、IL-6、TNF-α浓度有显著性差异，均为P＜0.05，说明了疾病状态对细胞因子的影响。牙周炎组中，rs11536889 GG组患者血清中TNF-α水平低于GC+CC组。慢性牙周炎伴COPD组中，rs11536889 GG基因型患者血清中IL-6水平显著高于GC+CC组。提示在牙周炎组和慢性牙周炎伴COPD组中，TLR4 rs11536889基因型多态性与TNF-α、IL-6的表达有关，可能增强了机体介导的炎症反应。

本研究从细胞因子角度初步探讨了TLR4基因多态性影响牙周炎及COPD易感性的发病机制。但是一方面纳入的样本量相对较少，另一方面由于病原体感染后人体内免疫反应的复杂性，可能是多个基因位点相互关联性调控，并且受微生物、环境、精神压力等其他混杂因素协同作用影响。为了证明TLR4基因多态性是否影响炎症通路中下游细胞因子的分泌，在蛋白水平研究其具体机制，还需要在体外实验和大样本量的病例对照研究中进一步分析。