信阳水牛成纤维细胞的体外培养及生物学特性分析

楚秋霞，于 翔，辛晓玲，施巧婷，滑留帅，王二耀，徐照学

(河南省农业科学院畜牧兽研究所,河南郑州 450002)

信阳水牛属于我国优良地方品种之一。主产于河南省信阳市，中心产区为信阳市的光山、罗山、固始、商城、新县等县区[1]。信阳水牛具有体型大、结构匀称、力大持久、性情温驯、耐粗饲等特性[2]。随着现代农业机械的发展，信阳水牛逐步从单纯的役用向乳用、肉用方向转化。信阳水牛1983年被列入《河南省地方优良畜禽品种志》，2003年被列入《中国畜禽遗传资源名录》。由此可见，信阳水牛有着举足轻重的保护价值。由于成纤维细胞是一种二倍体稳定的细胞，本研究从培养成纤维细胞入手，对该细胞的生物学特性进行了研究，使信阳水牛的遗传资源在细胞水平上得以长期保存。同时，也为体细胞克隆等研究提供理想的实验材料[3-4]。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 样品来源 信阳水牛耳缘组织，共采集自12头水牛，来自信阳水牛保种场。

1.1.2 主要试剂 高糖DMEM、胎牛血清(FBS)、胰蛋白酶，Gibco公司产品；DMSO、抗菌药物、PI染料等试剂及药品，美国Sigma公司产品；支原体，南京爱必梦试剂公司产品。

1.2 方法

1.2.1 样品采集和处理 选择健康的信阳水牛，用手术刀片除净耳毛并消毒。采样钳剪下耳尖组织，750 mL/L酒精中浸泡20 s，放入含有青霉素、链霉素的DPBS液洗3遍，4 h内带回实验室。

1.2.2 细胞原代及传代培养

1.2.2.1 原代培养 无菌处理组织样品，用眼科剪剪成 1 mm3大小的组织，接种于60 mm培养皿中，置于37.5℃、体积分数为5%的CO2培养箱，4 h加入培养液，隔24 h换液，3 d后观察细胞生长情况。

1.2.2.2 传代培养 当培养的细胞有80%～90%汇合时，进行传代，采用差速消化和差速贴壁法，纯化成纤维细胞[5-6]。每隔2 d换液1次，记录生长情况。

1.2.3 细胞冻存及复苏

1.2.3.1 细胞冻存 调整细胞密度为2×106个/mL，加入冻存液(100 mL/L DMSO+200 mL/L FBS+700 mL/L DMEM混合液)，放入细胞冷冻程序盒过夜，第2天投入液氮罐。

1.2.3.2 细胞复苏 从液氮中取出细胞冻存管，37℃水浴中快速解冻，用培养液悬浮细胞，1 000 r/min离心3 min，重悬细胞接种于60 mm培养皿。置入37.5℃、体积分数为5%的CO2培养箱中培养，4 h后换新鲜细胞培养液。

1.2.4 生物学特性研究

1.2.4.1 活力检测 细胞冻存前和复苏后进行活力检测。使用便携式细胞计数仪检测其活力，重复3次取平均值。

1.2.4.2 生长曲线 取指数生长期的细胞，用胰蛋白酶消化，调整细胞密度至1.0×104个/mL，接种到24孔培养板中，置入37.5℃、体积分数为5%的CO2培养箱培养。每隔24 h取3孔细胞计数取平均值，连续计数7 d。以培养时间为横坐标，细胞密度为纵坐标绘制生长曲线。

1.2.4.3 染色体分析 分别取第9代及第14代的细胞进行染色体统计分析。常规方法进行染色体制片[7-8]。

1.2.5 微生物检测

1.2.5.1 细菌、真菌检测 所有的待检细胞在无抗生素培养液中培养，传代后进行检测。在显微镜下观察有无活动的黑色颗粒；取培养过细胞的溶液接种到细菌培养基，37.5℃温箱过夜培养，观察是否有菌落出现[9-10]。

1.2.5.2 支原体检测 加入含有5 μg/mL Hoechst33342的DMEM培养基，常温放置10 min，荧光倒置镜下观察，判断是否有支原体污染[11-12]。

2 结果

2.1 细胞形态学观察

组织块培养3 d～4 d后便可见大量上皮样细胞与成纤维样细胞混杂生长，形成明显的生长圈，1周后便可铺满皿底。经2次～3次传代，获得较纯的成纤维细胞。细胞贴壁后大致呈梭形或不规则形，细胞核位于中央，生长时呈放射状、漩涡状走向。原代细胞及传代细胞见图1和图2。

2.2 细胞冻存前及复苏后活率

通过细胞计数仪活力测定，细胞冻存前活率平均达98.5%，复苏后活率平均达96.1%，细胞在冻存前和复苏后活率达95%以上。说明细胞生长状态很好。

图1 原代细胞(100×)

2.3 细胞生长曲线

生长曲线呈“S”型，经历了潜伏生长期、指数生长期及平台期。生长曲线表明信阳水牛成纤维细胞生长具有正常的分裂增殖特性(图3)。

2.4 染色体分析

信阳水牛第9代和第14代染色体核型见图4和图5。随着代数的增加染色体数目有明显的减少。通过流式检测细胞倍型(图6)，信阳水牛XY3-P9、XY10-P9及XY3-P14二倍体倍型分别为97.85%、97.94%和76.35%。显示通过细胞染色体倍性分析发现，信阳水牛成纤维细胞在第9代时具有正常的二倍体，二倍体比例在90%以上；而在14代时染色体数目及二倍体所占比例出现明显的变化。

图2 传代细胞(100×)

图3 信阳水牛成纤维细胞生长曲线

图4 第9代信阳水牛成纤维细胞染色体(40×)

图5 第14代信阳水牛成纤维细胞染色体(100×)

A.XY3-F9；B.XY10-F9；C.XY3-F14

图6信阳水牛成纤维细胞倍型分析

Fig.6 Ploidy analysis of Xinyang buffalo fibroblasts

2.5 微生物污染检测结果

待检细胞进行细菌、真菌污染检测，结果表明，无浑浊或其他变化，检测结果为阴性。在相差显微镜下观察，未见有病毒造成的细胞损伤现象。使用Hoechst 33342 荧光染料检测第6代信阳水牛成纤维细胞有无支原体污染，结果显示细胞表面光滑，仅细胞核发出蓝色荧光，细胞周围无丝状或颗粒状荧光点，检测支原体结果为阴性(图7)，支原体阳性对照组见图8。

图7 支原体阴性(40×)

图8 支原体阳性(100×)

3 讨论

细胞原代培养常用有2种方法，即消化法和组织块贴壁法培养。组织块贴壁法操作简单方便，长出的细胞整齐且对细胞损伤少，此法是建立成纤维细胞系的主要方法[13]。成纤维样细胞是由真皮层细胞分裂增殖而来，源于中胚层。上皮样细胞源于外胚层的细胞，所以首先生长的是上皮样细胞。成纤维样细胞由于母细胞数量少生长较慢。由此可见，本试验培养的信阳水牛耳组织在培养第3天首先出现内皮细胞，随后出现大量的成纤维细胞。1周后进行传代，对比发现信阳水牛比南阳牛成纤维细胞生长整齐，内皮细胞较少。

根据消化细胞所使用消化液的情况，本试验采用2.5 mg/mL胰蛋白酶和0.2 mg/mL EDTA联合消化，所得细胞的24 h 贴壁率明显高于不添加0.2 mg/mL EDTA的消化液，并且消化细胞所需时间短。根据胰酶对细胞的消化时间和附着时间不同进行细胞纯化[14]。信阳水牛成纤维细胞在第3代时获得较纯的成纤维细胞，细胞生长状态很好。生长曲线呈“S”型，符合细胞的正常生长规律。细胞的冷冻保存为动物资源的长期保存提供了有效的保存方法。影响细胞冻存的因素有冷冻温度、冷冻速度、冻融速度及冷冻保护剂类型。通过对信阳水牛成纤维细胞冻存前与复苏后的存活率测定，冻存前与复苏后的存活率均在95%以上，复苏后细胞生长旺盛，具有正常的细胞形态。

染色体检查是检测染色体的数目或结构有无异常的方法。在动物上主要用于检测染色体的数目是否保持正常的数目，以及核型是否完整，判断培养的细胞是否具有长期保存的价值。体外培养的信阳水牛成纤维细胞进行9代及14代染色体检测，结果显示，信阳水牛成纤维细胞第9代染色体数目为2N=60条，与沼泽型水牛染色体数目不一致，而为黄牛的染色体数，推测所采集的信阳水牛可能经过长期的选育形成的杂交品种。在第14代时染色体数目为41条，染色体数目明显的减少。通过流式细胞仪对二倍体进行检测，结果显示，信阳水牛XY3-P9、XY10-P9及XY3-P14二倍体倍型分别为97.85%、97.94%和76.35%。说明在10代之前细胞遗传性能比较稳定，然而随着体外培养传代代次的增加出现了变异。因此，在进行后续试验时，应根据试验的情况对细胞进行检测。

预防细胞污染是体外培养细胞的基本要求。细胞被细菌和病毒类污染容易发现，但是支原体污染却不易发现。本试验通过使用Hoechst 33342 荧光染料检测信阳水牛成纤维细胞，支原体检测结果显示细胞表面光滑，检测结果为阴性。在细胞培养中支原体感染发生率达到63%，支原体污染细胞后，培养液可不发生混浊，易被忽视[15]。细胞被支原体污染后严重影响细胞的生长发育，因此对细胞支原体的检测至关重要。