p-mTOR、p-4EBP1及p-S6K1在乳腺癌组织中的表达及临床意义

闫 斌，马 铎，于跃利，韩丽红*

(1.莆田学院基础医学部 福建省莆田 351100;2.内蒙古科技大学包头医学院第一附属医院普外二科,内蒙古包头 014010)

乳腺癌是全球范围内最常见女性恶性肿瘤之一，是女性癌症患者死亡的主要原因，女性癌症患者的死亡率为14%[1]。近年的研究发现,PI3K/AKT/mTOR信号通路在肿瘤细胞的细胞增殖、细胞周期、蛋白合成、新陈代谢、转化和血管生成等过程中发挥着重要的作用[2-3]。mTOR信号通路的异常激活和许多类型的恶性肿瘤密切相关，在甲状腺癌、乳腺癌、肺癌、食管癌等恶性肿瘤的发生、发展中的作用机制已有相关报道。mTOR及其上下游分子成为乳腺癌治疗的新靶点和主要预后指标的研究仍在进行中，进一步探讨该信号传导通路的调节机制与其他信号通路的关联，有助于人们针对mTOR信号途径来寻找新的抗肿瘤药物[4]。本试验通过免疫组织化学方法检测了2015年3月至2017年8月在包头市肿瘤医院就治的60例乳腺癌患者的乳腺癌组织及40例癌旁组织p-mTOR、p-4EBP1及p-S6K1的表达情况，为乳腺癌的进一步研究提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 病料 选自2015年3月至2017年8月于包头市肿瘤医院经手术根治切除的乳腺癌石蜡标本60例及癌旁组织(肿瘤边缘5 cm处)石蜡标本40例。纳入标准：经手术活检证实为乳腺癌，根治性手术治疗后留有石蜡包埋的组织标本，所有标本术前未接受化疗、放疗或内分泌治疗，无合并其他恶性肿瘤和遗传病史，且具备完整临床治疗；排除标准：男性乳腺癌，接受化疗、放疗、内分泌治疗。根据标准纳入60例女性乳腺癌患者，其中年龄≥45岁27例，<45岁33例；伴有淋巴结转移37例，无淋巴结转移23例；乳腺癌TNM分期标准进行分期：Ⅰ期11例，Ⅱ期32例，Ⅲ期17例。

1.1.2 试剂 p-mTOR(Ser2448)一抗、P-4EBP1(Ser64)、P-S6K1(Thr389)一抗，江苏厚普生物科技有限公司产品；抗体来源为兔，多克隆抗体，适用于人；HRP标记抗兔二抗，购于福州迈新生物公司(KIT5006)；DAB显色液，购于江苏厚普生物科技有限公司。

1.2 方法

1.2.1 操作流程 (1)温浴：将切片放置于62℃温浴箱内2 h。(2)切片脱蜡水化：将切片放置于二甲苯溶液中，每次15 min，共3次,使切片完全脱蜡，在梯度酒精中各浸泡5 min完全水化。(3)冲洗：用PBS冲洗脱蜡和水化后的切片3次，每次2 min，再用蒸馏水冲洗5 min。(4)修复抗原：柠檬酸盐修复液高压修复，高压加热2.5 min，取出切片冷却至室温。(5)洗片：PBS洗片3次，每次2 min。(6)内源性过氧化物酶活性阻断：将组织切片用30 mL/L H2O2室温孵育10 min。(7)洗片：PBS洗片3次，每次2 min。(8)一抗孵育：将冲洗完的切片擦拭后，加上一抗(p-mTOR稀释度1∶100；p-4EBP1稀释度1∶100；p-S6K1稀释度1∶50)4℃孵育过夜，次日37℃复温60 min,PBS洗片3次，每次2 min。(9)二抗孵育：加二抗后，将湿盒置于37℃温箱20 min，PBS洗片3次，每次2 min。(10)显色：向切片滴加新配制的DAB显示液2滴，置于显微镜下观察组织切片5 min～10 min，调整着色，适时滴加蒸馏水终止显色。(11)脱水摄片：梯度酒精脱水，二甲苯透明，中性树胶封固后置于显微观察并进行摄片。

1.2.2 染色结果的判断 通过特异性抗原抗体反应，使细胞质和(或)细胞核中出现棕黄色颗粒为阳性标准，以0.01 mol/L PBS替代一抗作为阴性判断标准。采用双盲法阅片，染色结果由2名病理科副主任医师分别独自判读,对于不一致的判读结果经商讨后得出一致结论。参照文献[5]的标准，阳性细胞数0为(-)，0～20%为(±)，21%～80%为(+)，>80%为(++)；(-)和(±)为阴性，(+)和(++)为阳性。

1.2.3 统计方法 采用SPSS20.0软件，组间阳性率比较采用四格表2检验及Fisher确切概率法检验，组间阳性率相关性采用Spearman相关分析检验，检验标准以P<0.05表示差异显著。

2 结果

在本次试验的60例乳腺癌组织和40例癌旁组织中，p-mTOR、p-4EBP1、p-S6K1主要表达于乳腺组织的细胞核和细胞质内，呈棕褐色(图1、图2及图3)。最后得出p-mTOR在乳腺癌组织中阳性表达的例数为43例，阳性率为71.7%(43/60)，癌旁组织中p-mTOR阳性表达的例数为17例，阳性率为42.5%(17/40)，乳腺癌组的阳性表达率明显高于癌旁组，二者差异有统计学意义(P<0.05)。p-4EBP1在乳腺癌组织中阳性表达的例数为16例，阳性率为26.7%(16/60)，癌旁组织中p-4EBP1阳性表达的例数为4例，阳性率为10.0%(4/40),乳腺癌组的阳性表达率明显高于癌旁组，二者差异有统计学意义(P<0.05)。p-S6K1在乳腺癌组织中阳性表达的例数为27例，阳性率为45.0%(27/60)，癌旁组织中p-S6K1阳性表达的例数为例，阳性率为12.5%(5/40)，乳腺癌组的阳性表达率明显高于癌旁组，二者差异有统计学意义(P<0.01)(表1)。

表1 p-mTOR、p-4EBP1及p-S6K1在乳腺癌中的表达情况

A.p-mTOR在癌旁组织中的表达主要在乳腺组织细胞质中(20×10)；B.p-mTOR在乳腺癌组织中的表达主要在乳腺组织细胞质中(20×10)

A.Expression of p-mTOR in paracancerous tissues is mainly in the cytoplasm of breast tissues(20×10); B.Expression of p-mTOR in breast cancer tissues is mainly in the cytoplasm of breast tissues(20×10)

图1 p-mTOR在癌旁组织及乳腺癌组织中的表达
Fig.1 Expression of p-mTOR in paracancerous tissues and breast cancer tissues

A.p-4EBP1在癌旁组织中的表达主要在乳腺组织细胞质和细胞核中 (20×10); B.p-4EBP1在乳腺癌组织中的表达主要在乳腺组织细胞质和细胞核中(20×10)

A.Expression of p-4EBP1 in paracancerous tissues is mainly in cytoplasm and nucleus of breast tissues(20×10); B.Expression of p-4EBP1 in breast cancer tissues is mainly in cytoplasm and nucleus of breast tissue(20×10)

图2 p-4EBP1在癌旁组织及乳腺癌组织中的表达
Fig.2 Expression of p-4EBP1 in paracancerous tissues and breast cancer tissues

A.p-S6K1在癌旁组织中的表达主要在乳腺组织细胞质和细胞核中 (20×10); B.p-S6K1在乳腺癌组织中的表达主要在乳腺组织细胞质和细胞核中(20×10)

A.Expression of p-S6K1 in paracancerous tissues is mainly in cytoplasm and nucleus of breast tissue(20×10); B.Expression of p-S6K1 in breast cancer tissues is mainly in cytoplasm and nucleus of breast tissue(20×10)

图3 p-S6K1在癌旁组织及乳腺癌组织中的表达
Fig.3 Expression of p-S6K1 in paracancerous tissues and breast cancer tissues

3 讨论

乳腺癌的发生是一个多级别、多步骤的过程，它涉及原癌基因的激活、抑癌基因的失活，导致了相关蛋白合成障碍，最终改变细胞生物学行为，从而导致了肿瘤的生成。而m-TOR信号通路是细胞内一个重要信号通路，它的异常激活与乳腺癌的发生、发展有着密切关系[5]。而且mTOR信号通路的紊乱影响许多非恶性肿瘤疾病的病理生理，如心血管，神经退行性疾病和各种各样的肾脏疾病。mTOR的活性受多种调节信号蛋白的影响，主要包括3条信号通路调节，分别是PI3K/AMPK/mTOR、LKB1/AMPk/mTOR和氨基酸通路。

哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamycin，mTOR)是一种进化上十分保守的蛋白激酶，通过整合生长因子，氨基酸和能量等环境信号发挥着重要的作用[6]。mTOR在生物体内以mTORC1和mTORC2两种形式存在，mTORC1控制蛋白质合成、细胞生长、增殖、细胞代谢反应，mTORC2调节着细胞的生存期。mTOR激活后，可磷酸化其下游分子4EBP1和S6K1，进而增强蛋白质的合成，促进肿瘤的生长、增殖、迁移及肿瘤血管的生成。因此，mTOR途径的过度激活会导致细胞生长和增殖，也可以刺激肿瘤细胞的增殖。4EBP1和S6K1是目前研究最广泛的mTOR的底物。

根据基因表达谱和分子生物学标记物的表达情况，可以将乳腺癌分为4种亚型，即Luminal A型、Luminal B型、HER2过表达型和三阴性乳腺癌[7]。信号通路的异常激活在不同亚型乳腺癌中存在差异。王杰等[8]采用组织芯片技术和免疫组化染色方法,检测p-mTOR在75例Luminal A型乳腺癌患者和136例Luminal B型乳腺癌患者中的表达情况及其与临床病理特征和预后的关系。得出p-mTOR在乳腺癌不同亚型患者中的多样化表达特点提示不同的疾病行为及预后意义。p-mTOR作为Luminal B型乳腺癌的独立预后因素,是潜在的有效靶点。本研究结果显示p-mTOR在观察组和对照组的阳性率分别为71.7%和42.5%，p-4EBP1在观察组和对照组的阳性率分别为26.7%和10.0%，p-S6K1在观察组和对照组的阳性率分别为45.0%和12.5%。p-mTOR、p-mTOR及p-S6K1 在胃癌组织当中相应表达水平高于癌旁组织，差异显著(P<0.05)。上述结果显示mTOR、4EBP1和S6K1在乳腺癌组织中高表达，提示mTOR、4EBP1和S6K1可能与乳腺癌的发生有密切关系，为mTOR、4EBP1和S6K1是否能作为乳腺癌的标记物提供更多的证据。已有研究发现mTOR磷酸化水平从正常的乳腺组织到不典型增生的乳腺组织，再到恶性转化的组织，以致到肿瘤浸润的组织中逐渐增加。

已报道mTOR信号通路异常存在于胃癌、肺癌等恶性肿瘤中[9]。一些机制仍然没有阐明清楚，例如mTOR如何协同其他信号通路和蛋白质调控细胞的运动和入侵；mTOR是如何调节细胞黏附/去黏附功能的。显然，需要更多的研究来阐明这些机制，增加对肿瘤转移理解，并为新的抗肿瘤药物的研发提供更多的证据[10]。

综上所述，mTOR及其下游信号分子4EBP1和S6K1在乳腺癌中的表达升高与乳腺癌的发展有关，可通过进一步研究乳腺癌中mTOR及其下游信号分子4EBP1和S6K1与病理分期、生存期的研究，对于临床上对乳腺癌的诊断和治疗有一定的指导意义。