Box-Behnken响应面法优化穿心莲内酯自微乳的制备工艺Δ

龙凯花，王春柳，李晔#，张红，刘洋，孙婷婷，宗时宇

（1.西安培华学院医学院，西安 710125；2.陕西省中医药研究院，西安 710003）

穿心莲内酯（Andrographolide）又名穿心莲乙素，为爵床 科 植 物 穿 心 莲 [Andrographis paniculata（Burm.f.）Nees]全草或叶中的主要有效成分之一，具有散热解毒、消炎止痛的功效，对病毒性痢疾及上呼吸道感染有特殊疗效[1-3]，被誉为“天然抗生素”。但穿心莲内酯存在难溶于水、味极苦、口服生物利用度低、易致呕吐等问题[4]。

自微乳给药系统（Self-microemulsifying drug delivery system，SMEDDS）是由油相、乳化剂和助乳化剂组成的均匀、澄清的液体系统。该系统在胃肠道内可通过胃肠道蠕动自发形成粒径小于100 nm的水包油（O/W）型乳剂，可作为生物利用度低、难吸收等药物的优良载体，通过增加药物的表面积和溶解度，使药物易于通过胃肠壁水化层传递到吸收部位[5-7]。为此，本研究采用Box-Behnken响应面法优化穿心莲内酯自微乳的制备工艺，旨在为开发其适用于临床的新剂型提供参考。

1 材料

1.1 仪器

1260型高效液相色谱（HPLC）仪，包括G1311B四元泵、G1329B自动进样器、G1316A柱温箱、G4212B二极管阵列检测器、Open LAB色谱数据工作站（美国Agi-lent公司）；BP211D型十万分之一电子分析天平（德国Sartorius公司）；HJ-6型多头磁力加热搅拌器、SHA-C型恒温振荡器（常州国华电器有限公司）；ZEN3600型激光粒度仪（英国Marloven公司）；TGL-16G型离心机（上海安亭科学仪器厂）；FOEA26810D型超纯水系统（美国Millipore公司）；KQ-250DE型超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司）。

1.2 药品与试剂

穿心莲内酯原料药（西安天一生物技术有限公司，批号：TYM140216，纯度：98.0%）；穿心莲内酯对照品（中国食品药品检定研究院，批号：110797-201108，纯度：98.7%）；油酸乙酯（Ethyl oleate，上海飞祥化工厂，批号：20100908）；单亚油酸甘油酯（Maisine 35-1，批号：141597）、油酸聚乙二醇甘油酯（Labrafil M 1944 CS，批号：146917）、辛酸癸酸聚乙二醇甘油酯（Labrasol，批号：201006）、聚甘油脂肪酸酯（Plurol®Oleique CC 497，批号：127923）、二乙二醇单乙基醚（Transcutol HP，批号：145177）均由法国嘉法狮公司提供；辛酸癸酸三甘油酯（Crodamol GTCC，批号：126715）、聚氧乙烯氢化蓖麻油（Cremophor RH 40，批号：145179）、聚乙二醇硬脂酸酯（Kolliphor®HS 15，批号：29749816K0）均由德国BASF公司提供；油酸（天津津北精细化工有限公司，批号：20100604）；肉豆蔻酸异丙酯（IPM，批号：F20100420）、1，2-丙二醇（批号：T20090119）、聚乙二醇（PEG 400，批号：20100729）均由国药集团化学试剂有限公司提供；聚山梨酯80（大连金州无机化工厂，批号：060307）；泊洛沙姆188（Lutrol®F 68，北京凤礼精求商贸有限责任公司，批号：WPEE587E）；水为纯化水。

2 方法与结果

2.1 自微乳的制备

精密称取穿心莲内酯原料药、乳化剂及助乳化剂适量，置于锥形瓶中，于37℃水浴中溶解，振荡混匀；加入油相，于37℃水浴中振荡混匀，制得穿心莲内酯自微乳。另精密称取乳化剂及助乳化剂适量，置于锥形瓶中，于37℃水浴中溶解，振荡混匀；加入油相，于37℃水浴中振荡混匀，制得空白自微乳。

2.2 处方的筛选

2.2.1 基质种类的筛选 通过前期穿心莲内酯的不同乳化剂、助乳化剂及油相的溶解度试验[8]，初步筛选出基质种类配伍组合，并按“2.1”项下方法制备穿心莲内酯自微乳，以外观、滴入水相中颜色为评价指标，进一步筛选基质结果，结果见表1。

由表1可知，处方3的基质种类配伍较为理想，即油相为油酸聚乙二醇甘油酯，乳化剂为聚氧乙烯氢化蓖麻油，助乳化剂为二乙二醇单乙基醚，此时所得的自微乳外观澄清、透明，滴入水相中呈现出微泛淡蓝色乳光。

2.2.2 基质用量范围的筛选 将乳化剂与助乳化剂按不同质量比（1∶2、2∶3、1∶1、3∶2、2∶1）振荡混匀后，与油相按不同质量比（1∶9、2∶8、3∶7、4∶6、5∶5、6∶4、7∶3、8∶2、9∶1）振荡混匀，滴入水相中。以乳化剂与助乳化剂、油相和水相分别为一条边，绘制伪三元相图，通过外观（是否澄清、透明）和体外乳化试验（加入水相中是否澄清、透明或是否微泛淡蓝色乳光），确定可形成的自微乳区界限，绘制穿心莲内酯自微乳区域，详见图1（图中，Km为乳化剂与助乳化剂质量比，A为自微乳区域）。

表1 不同基质种类筛选结果Tab 1 Type screening of different matrix

图1 乳化剂与助乳化剂不同质量比的伪三元相图Fig 1 Pseudo-ternary phase diagram of emulsifier and co-emulsifier with different weight ratio

由图1可知，Km无论取哪个比例，所得的自微乳均澄清、透明，且滴入水相中均呈现出微泛淡蓝色乳光，同时穿心莲内酯自微乳区域可随Km的增加而增大，故确定Km范围为1∶2～2∶1。

2.3 响应面法的考察指标

2.3.1 粒径（Y1） 按“2.1”项下方法制备不同处方的穿心莲内酯自微乳，加水稀释50倍，采用激光粒度仪测定Y1。Y1越小表示穿心莲内酯自微乳越稳定。

2.3.2 分散指数（Y2） 按“2.1”项下方法制备不同处方的穿心莲内酯自微乳，加水稀释50倍，采用激光粒度仪测定Y2。Y2越小表示穿心莲内酯自微乳分子量分布越均匀。

2.3.3 平衡溶解度（Y3） 将过量穿心莲内酯分别加入按“2.1”项下方法制备的不同处方的空白自微乳中，密封超声（功率：200 W，频率：40 kHz）处理30 min，置于37℃水浴中振荡24 h平衡；4 000 r/min离心15 min，取上清液，加水稀释10倍，采用HPLC法测定Y3。Y3越大表示穿心莲内酯自微乳载药量越大。

2.3.4 综合评分（OD） OD＝（Y1/Y1max）×20%+（Y2/Y2max）×20%+（Y3/Y3max）×60%[9]。

2.4 响应面法优化制备工艺

2.4.1 试验设计与结果及建模 采用Box-Behnken响应面法，以乳化剂质量分数（A）、助乳化剂质量分数（B）、油相质量分数（C）3个因素为响应因子，以Y1、Y2、Y3为考察指标，以OD为响应值，采用3因素3水平设计试验，每个水平平行试验3次求其平均值[10]。因素与水平见表2，试验方案与结果见表3。

表2 因素与水平Tab 2 Factors and levels

表3 试验方案与结果Tab 3 Trial plan and results

采用Design-Expert 8.0.6软件对表2的试验数据进行多元线性回归和二次多项式拟合回归。结果，多元线性回归模型为OD＝0.67－0.12A+0.065B+0.003 893C+0.027AB－0.024AC+0.032BC（r＝0.656 9），r值较小，表明各变量间线性相关性较差，模型拟合度不佳、预测性较差。二次多项式拟合回归模型为OD＝0.59－0.12A+0.065B+0.003 893C+0.027AB－0.024AC+0.032BC+0.12A2+0.035B2－0.000 145 4C2（r＝0.955 7），r＞0.09，提示模型拟合度较好、预测性较好。对该模型进行方差分析，结果见表4。

表4 方差分析结果Tab 4 Results of variance analysis

由表4可知，所建模型经检验具有显著性（P＝0.000 6），说明模型与实际情况吻合良好；模型失拟项检验不具有显著性（P＝0.462 8），说明未知因素对模型拟合结果干扰小，模型误差较小。

2.4.2 各因素交互作用分析 采用Design-Expert 8.0.6软件，分别以乳化剂质量分数（A）、助乳化剂质量分数（B）、油相质量分数（C）为响应因子，以OD为响应值，绘制响应面和等高线图，详见图2。

图2 各因素对OD影响的响应面和等高线图Fig 2 Response surface and contour map of the effects of each factor on the comprehensive score

由图2可知，因素A与B、因素A与C、因素B与C的交互作用均显著。图2A、B提示，OD在因素A与B的交互作用下，随二者的增大而出现先减小后增大的趋势；图2C、D提示，OD在因素A与C的交互作用下，随二者的增大也出现先减小后增大的趋势；图2E、F提示，OD在因素B与C的交互作用下，随二者的增大而增大。

2.4.3 最优制备工艺的确定 基于Design-Expert 8.0.6软件对所建模型进行参数最优分析，得最优制备工艺为：聚氧乙烯氢化蓖麻油（乳化剂）、二乙二醇单乙基醚（助乳化剂）、油酸聚乙二醇甘油酯（油相）的质量比为40.53∶59.51∶10。考虑到实际操作的可行性，确定质量比为40∶59∶10。

2.4.4 验证试验 对上述最优制备工艺进行验证，平行制备穿心莲内酯自微乳3批，对其相关指标进行测定，结果见表5、图3、图4。由表5、图3、图4可知，按上述工艺制备的穿心莲内酯自微乳粒径、分散指数、平衡溶解度实测值与预测值的一致性良好，Zeta电位平均值为－27.15 mV，表明优化所得的穿心莲内酯自微乳制备工艺稳定、可行。

表5 最优制备工艺验证结果Tab 5 Verification results of optimal preparation technology

图3 粒径分布Fig 3 Distribution of particle size

图4 Zeta电位分布Fig 4 Distribution of Zeta potential

3 讨论

本研究选择聚氧乙烯氢化蓖麻油为乳化剂，其亲水疏水平衡值为14～16，乳化能力强；同时，聚氧乙烯氢化蓖麻油能抑制P糖蛋白的“药物溢出泵”作用，可提高口服药物的吸收率[11]。以外观、滴入水相中颜色为指标，筛选乳化剂、助乳化剂和油相种类；在溶解度试验的基础上，根据所确定的乳化剂、助乳化剂和油相组方绘制伪三元相图，该图仅能筛选各基质的用量范围，并不能确定具体的用量值。而采用Box-Behnken响应面法可进一步根据限定的用量范围，来确定乳化剂、助乳化剂、油相的具体用量。该法能避免人为取点的干扰，与正交设计法和均匀设计法相比，该法可选择多种线性或非线性模型，以寻求最优工艺参数，使优化后的工艺更稳定[12]。

本研究优化后的最佳制备工艺为：乳化剂为聚氧乙烯氢化蓖麻油，助乳化剂为二乙二醇单乙基醚，油相为油酸聚乙二醇甘油酯，三者质量比为40∶59∶10。按优化工艺制备所得穿心莲内酯自微乳的粒径为（38.15±1.56）nm，粒径小、易吸收。

综上所述，本研究优化所得穿心莲内酯自微乳制备工艺稳定、可行，适用于该制剂的制备。