Notch信号通路在针刺治疗中枢神经系统疾病中作用机制研究*

王 静，秦 悦，刘 群，唐雨佳，武煜明，蔡恩丽，褚 鑫

(云南中医药大学,云南 昆明 650500)

中枢神经系统(Central nervous system,CNS)由脑和脊髓组成，血液循环障碍、代谢紊乱、感染及中毒等均可导致CNS疾病发生，且多伴有各种并发症。如脑卒中(cerebral stroke)作为常见性难治疾病，治疗极为棘手。CNS受损时，机体自身部分神经干细胞(NSCs)可被激活、迁移，发挥修复和代偿作用。同时相关信号通路被激活，Notch信号通路作为调节NSCs增殖分化的重要信号通路，因此针刺干预此通路治疗中枢神经系统疾病成为目前研究热点。

1 Notch信号通路

1.1 Notch信号通路概述

Notch信号通路是一条在调节干细胞增殖分化和细胞凋亡等领域起重要作用的高度保守的细胞通路。Notch基因编码一种膜蛋白受体，由Notch受体、Notch配体即DSL(Delta,Serrate,Lag-2)蛋白和细胞内效应器分子(CSL-DNA结合蛋白)3部分组成，在不同物种中具有高度同源性。

1.2 Notch信号通路的机制

在哺乳动物中, Notch受体可以分为4个类型, 即 Notch1-4，是一种膜蛋白，它由胞内段、跨膜段和胞外段3部分组成[1-2]。Notch信号的产生是通过相邻细胞的Notch配体与受体相互作用，由胞内段(intracelluar domain of Notch,NICD)将细胞信号传至细胞核,与转录因子CSL家族(CBFI/Suppressor of Hairless/LAG-1 famliy)结合,形成 NICD/RBP-JK/MAML转录激活复合体，从而发挥调节靶基因抑制物的作用。Notch信号通路的靶基因碱性-螺旋-环-螺旋(basic helix-loop- helix,bHLH)对NSCs 未分化状态的维持起着非常重要的作用,这种信号转导途径有CSL家族蛋白的参与被叫做CSL依赖途径[3]。这种经典的Notch信号通路, 在哺乳动物体内, 也叫做CBF-1/RBP-Jκ依赖途径, 哺乳动物的下游靶基因为Hes(Hairy and enhancer of split)，包括Hes1-7，但是hes家族成员在某单一动物体中不一定全部存在[4]。其作为通路下游靶基因对神经前体细胞的增殖分化进行调控，不同的Hes作用不同。如Hes1转录表达能够促进神经前体细胞进行自我更替与增殖;Hes3作为Notch通路的重要效应基因，主要作用为促进神经元的增殖，并且帮助未分化的神经元维持其形态[5]。对神经干细胞的维持和抑制分化起着决定性作用的是Notch信号，但哺乳动物脑内多潜能干细胞分化功能需要Notch和Hes基因共同维持[6]。

2 Notch信号通路在针刺治疗脑卒中的作用机制

2.1 针刺调节Notch信号通路促进缺血性脑卒中血管新生

血管内皮生长因子(Vascular endothelial growth factor,VEGF)作为一种具有高度特异性的促血管内皮细胞生长因子，有促进血管内皮细胞的迁移、增殖和血管形成等作用。内皮抑素(endostatin,ES)是一种血管抑制剂，主要作用为特异性抑制血管内皮细胞生成。针刺刺激Notch通路能有效调控与VEGF相关的因素，以增强或减弱地表达于血管，从而治疗缺血性脑卒中。血管生成的关键调控因子VEGF受体的表达增多，可有效调控血管密度升高以改善脑缺血情况，GRIDLEY[7]在其研究中发现Notch通路的激活能够促使VEGF受体表达增加，而VEGF受体是调控血管密度的重要因子，Notch信号的改变可以使血管密度降低或者增加。这一结果与杨敏等[8]研究相同，头针可能通过激活Notch通路，增加脑缺血区VEFG的含量与减少ES含量以促进脑缺血损伤后血管的新生，改善缺血区的血液供应和恢复神经功能。王拯等[9]研究发现,Notch信号通路与血管内皮生长因子及其他信号通路可相互协调于血管新生这个过程，但其他信号通路在影响血管再生方面与Notch通路关联性强弱不等，这也为研究其他通路是否参与调控脑缺血损伤的修复提供新角度。

2.2 针刺调节Notch信号通路促进缺血性脑卒中NSCs增殖

Notch信号通路参与NSCs的更新，一方面是因为活化的Notch信号通路调节Hes家族表达并抑制bHLH转录因子的表达,直接参与NSCs的自我更新；另一方面, Notch信号通路本身参与调控细胞周期的长短从而间接影响NSCs的自我更新[1]。配体、受体的增加往往促使下一阶段的生化反应更活跃，Zhao等[10]电针百会穴预处理脑缺血(MCAO)大鼠后发现，缺血再灌注后大鼠纹状体中Notch1、Notch4受体和Jag1配体的表达显著增加。电针预处理大鼠纹状体中Hes1基因在缺血再灌注早期表达明显增高，Hes5基因在缺血再灌注后中期表达明显升高。NICD蛋白含量在再灌注后24 h达到高峰，且较对照组提前，这提示通过Notch信号通路调控机体可能提前开始脑缺血损伤的修复。Tao等[11]实验观察到活化的 Notch1信号转导通路，可增加海马区巢蛋白(Nestin)阳性细胞表达，并且能促进脑源性神经营养因子(BDNF)和胶质源神经营养因子(GDNF)等的分泌，从而发挥对脑缺血的治疗作用。在陶静等[12]的实验研究中同样发现，经过电针处理后，缺血周围区皮质和缺血侧室管膜下区( subventricular zone，SVZ)Notch1信号转导通路有活化趋势，使活化的NICD蛋白数量增加，并且能够让Hes1和Hes5的表达激活，从而加快缺血损伤后NSCs的增殖。采用γ分泌酶抑制剂(DAPT)阻断Notch信号转导通路时，电针促进神经干细胞增殖现象被抑制，减少神经细胞的分化。表明电针可拮抗DAPT，调控神经细胞增殖分化，从而改善脑缺血后的功能障碍[13-14]。

神经上皮干细胞蛋白(neuroepithelial stemcell protein,Nestin)即巢蛋白，Nestin的表达在神经干细胞中起于胚胎时期，随着神经干细胞的不断迁徙，其表达逐渐减低，当神经细胞分化成熟后停止表达。Nestin现广泛用于鉴定神经干细胞，可通过Nestin反映大鼠海马神经干细胞的增殖情况[15]。波形蛋白(Vimentin)属于中间丝蛋白的一种，能被神经祖细胞(progenitor)/前体细胞(precusor)和神经干细胞(neural stem cell, NSC)表达，它具有自我分化和更新的能力，因此为神经系统非再生性疾病的治疗提供了新方法[16]。Ki-67是一种核蛋白质，可提示细胞的增殖活跃程度，其阳性表达呈棕色或褐棕色，定位于细胞核内作为细胞增殖指标。电针处理曲池、足三里后[15]，脑缺血再灌注损伤大鼠脑梗死体积明显减少，大鼠脑缺血区周围皮质及缺血侧室管膜下区(subventricular zone,SVZ)的Ki-67、Nestin和Vimentin阳性细胞数均有显著增加，表明神经干细胞有增殖情况。7天后缺血周围皮质区及缺血侧SVZ区中JAG1、NICD、Hes1、Hes5蛋白表达明显增加。其机制可能为针刺活化Notch通路，释放NICD上调Hes1、Hes5的表达，从而促进缺血区周围皮质及缺血侧SVZ区NSCs的增殖。另一电针干预实验中[15]，脑缺血大鼠的神经功能障碍得到明显改善，并且使Notch信号通路激活，其中的NICD和Notch1受体的表达增强，加强海马神经干细胞的增殖，从而起到治疗脑缺血的作用。醒神开窍针刺法治疗缺血性中风[17]，也证实针刺能通过调节Notch信号通路，对NSCs增殖和分化起到一定促进作用，从而促进中枢神经系统疾病的修复。Notch 信号通路对于NSCs的增殖分化和内源性NSCs的维持都是不可或缺的，因此Notch 信号通路对机体神经再生的调节具有重要意义。并由此推测成体哺乳动物脑梗死后如果在某种刺激下能够产生足够量的内源性NSCs，并分化为神经元、胶质细胞，将能够有效治疗神经功能缺损和改善肢体运动功能。由于参与神经干细胞自我更新的因素繁多，和Notch信号通路之间的关联性并不明确，王珏等在其综述中指出的，关于Notch通路作用特定时间点的研究可能在未来对于NSCs增殖分化的干预产生更深远的影响[1]。

3 Notch信号通路在针刺治疗非脑卒中相关疾病中的研究

3.1 针刺调节Notch信号通路增强神经可塑性

相关研究表明[18]神经可塑性特别是海马齿状回的神经可塑性可能是抑郁症治疗的入手点[19]。神经细胞突起的扩展和生长也受Notch信号通路的影响，在神经元培养中，Notch信号刺激轴突分支抑制轴突生长，在不同阶段Notch1、其配体Jagged1及其下游靶基因Hes-1对神经元轴突的影响显示不同的活性。微管结合蛋白(MAP-2)作为神经元树突标志物，可参与突触可塑性和神经突起生长过程。邓雪等基于此实验发现,电针组海马组织中MAP-2蛋白及Notch蛋白的表达量大于模型组，Jagged1和Hes1蛋白表达量小于模型组。可知以“肾脑相济”理论为指导的电针疗法治疗围绝经期抑郁症可能是通过调节Notch信号通路以影响海马神经细胞可塑性而发挥作用的。电针百会、印堂等穴位治疗抑郁症可达到与药物治疗相同的效果，甚至在某些方面针刺治疗效果优于药物治疗。艾灸处理血管性痴呆(Vascular dementia,VD)大鼠[20]，可明显见到Notch1、Hes3 mRNA的表达增强，Notch1受体被刺激并表达，激活Notch信号转导通路，下游靶基因Hes3被激活，抑制神经元分化，从而显著改善大脑缺血缺氧的状态，虽然不能完全抑制脑损伤和缓解脑缺血状态，但能减少脑损伤的发生。

3.2 针刺调节Notch信号通路抑制神经胶质细胞不可逆分化

影响脊髓内神经干细胞的生成和分化的因素有很多，其中一个重要原因是大量促神经胶质分化的信号在脊髓损伤(SCI)后十分活跃，Notch信号的表达也显著增强[21]。许多临床实践证,实电针可促进脊髓损伤后的神经功能恢复，Notch信号作为一种促神经胶质分化信号在脊髓损伤后被激活，表达增强，可加速并促进NSC向胶质细胞不可逆性的分化。时素华等[22]实验发现,电针处理后Notch1和ps1的表达升高且较使用药物显著。由此可知电针可通过明显增加Notch1和ps1表达从而抑制神经细胞向胶质细胞分化减轻大鼠脊髓损伤，促进脊髓损伤的再生和修复。Geng等[23]发现，电针“命门”“大椎”穴位后明显抑制了脊髓损伤大鼠局部Notch1、Notch3、Notch4及Hes1mRNA的表达，阻止脊髓内增殖的神经干细胞向星形胶质细胞分化，从而避免了星形胶质细胞阻碍SCI修复。

4 小结

近年来，随着中枢神经系统疾病发病率和死亡率的增高，对中枢神经系统疾病的治疗方法也在不断发展，大量临床实践证明，针刺治疗中枢系统疾病具有较好的疗效，针刺具有调理气血、扶正固本和疏通筋脉的作用，能促进建立脑血管侧支循环和改善机体“内结内瘀”的病理状态[24]，但针刺疗法治疗中枢系统疾病的作用机制尚未明确。

Notch信号通路是一条对调节干细胞增殖分化和细胞凋亡等起重要作用的细胞通路。首先，Notch信号通路在神经干细胞的维持和抑制分化方面起着决定性的作用，能促进神经前体细胞进行自我分化增殖[6];其次，Notch信号通路的激活能增加血清中VEGF的分泌和减少ES的表达从而促进血管的再生[8],Notch信号通路也能够直接或间接参与NSCs的自我更新;此外，Notch信号通路可以通过影响海马神经细胞可塑性而发挥对抑郁症的治疗作用，Notch信号还能作为一种促神经胶质分化信号在脊髓损伤后被激活，从而促进脊髓损伤的恢复。

综上，Notch信号通路在针刺治疗中枢神经系统疾病中具有重要作用，但针刺治疗中枢系统疾病是多通路为媒介作用的结果[1]，因此Notch信号通路和其他通路之间如何共同作用参与治疗中枢神经系统疾病整个过程的机制以及Notch信号通路在特定时间点的作用值得进一步探究。