猪精液冷冻保存技术的影响因素及损伤机理

谷圣臣，张兆博，郑丽云，周琳琳，王 双，魏国生，李井春

（黑龙江八一农垦大学动物科技学院，黑龙江 大庆 163319）

猪精液冷冻保存是指通过干冰、液氮、液氦等制冷剂的降温作用，将采集到的新鲜精液进行离心、稀释、降温平衡、分装等工序，冷冻保存于超低温环境中，当温度升高后，又可恢复其生理活性，使其具有受精功能的一个过程[1]。猪精液的冷冻保存不仅提高了优良种公猪的利用率，而且对于我国的一些优秀地方品种遗传资源的保护具有重大意义[2]。但由于人们对猪精液的冷冻- 解冻机理和损伤机理等尚未完全掌握，在一定程度上限制了猪精液冷冻保存技术的发展。

1 猪精液冷冻保存的影响因素

1.1 稀释液

精子细胞在冷冻的过程中，仅仅依靠精凊的自身保护作用是不够的，还需要向精液中添加稀释液，从而能更好地保护精子，减少低温打击对精子活率、顶体完整性等所造成的不利影响。稀释液的主要成分有：糖类、蛋白质及脂蛋白、冷冻保护剂、抗氧化剂、缓冲液、其他添加剂等。1）糖类包括葡萄糖、蔗糖、乳糖、果糖、海藻糖等，经研究表明，海藻糖能降低精子外周渗透压，减少精子向外流失水分，从而提高精液冷冻保存的效果[3]。2）冷冻保护剂包括甘油、卵黄、乙二醇、丙二醇等，根据其能否穿过精子质膜进入精子细胞，冷冻保护剂又可分为渗透性保护剂和非渗透性保护剂，渗透性保护剂主要有甘油、卵黄、乙二醇、丙二醇等，他们的分子量小，能更好地结合水分子，使溶液的黏度增加，减少冰晶对精子所产生的损伤[4]。甘油对精子既有保护作用，同时对精子质膜和顶体又有损害作用，影响精子活率，经研究表明，稀释液中甘油含量为2% ～4%时, 精子所受到的损伤最小，精子冷冻后成活率最高[5]。非渗透性保护剂主要是指糖类和醇酮类，主要有葡萄糖、蔗糖、海藻糖、聚乙二醇等，研究表明，糖类与甘油的结合使用能更加有效地保护精子，降低精子的死亡率[6]。非渗透性保护剂能溶于水，但不能进入精子细胞，从而有效提高精子外周渗透压，当温度降低时，精子外周的高渗溶液会吸收精子细胞内的水分，减少冰晶对精子产生的损害。3）一般来说，精子在代谢过程中产生的活性氧（reactive oxygen species,ROS）处于一个动态平衡，然而当温度大幅变化时，ROS 的产生量大于分解量，就会对精子质膜产生损伤，在稀释液中添加抗氧化剂可以降低这种损伤，抗氧化剂主要包括：维生素C、维生素E 等维生素类，以及超氧化物歧化酶、过氧化氢酶等酶类[7]。4）缓冲溶液和添加剂主要包括柠檬酸、磷酸盐、抗生素等。

1.2 稀释方法

最常用到的稀释方法包括一次稀释法和二次稀释法。一次稀释法是根据精子的活率和密度，直接将精液和含有甘油的稀释液等温混合后分装并冷冻的方法，这种方法没有考虑到甘油和冷休克对精子所造成的损伤，一般不采用。二次稀释法的优点在于，考虑到了精子在降温过程中会产生冷休克，降低精子成活率，给精子一个缓冲的平衡时间，可以很好地减轻这种损伤，以15 ℃和5 ℃为界点。首先，将室温环境中的精液和不含甘油的稀释液Ⅰ混合均匀，1 h 之内使温度降至15 ℃并保持3 ～4 h ；其次，再用1 h 的时间将温度降至5 ℃并保持2 h ；最后将精液与含甘油的稀释液Ⅱ等温混合，分装并置于液氮中冷冻[8]。

1.3 冷冻温度和速度

当采用不同的冷源时，其冷冻温度也不一样，精子最佳入液氮温度为-120 ～-20 ℃，研究表明，入液氮温度越低，精子的成活率越高[9]。冷冻速度在精液的冷冻过程中也发挥着重要作用，在冷冻过程中，应使精子尽可能快地通过危险温区（-60 ～0 ℃），因为此时精液正处于由液态向玻璃态转变的过渡时期，此时精子细胞内外会产生大量冰晶，这些冰晶能刺破精子质膜，从而对精子产生损害。

1.4 冷冻剂型

猪精液最常用的冷冻保存形式有：颗粒、0.25 mL 细管、0.5 mL细管、5 mL 细管、塑料（铝箔）袋等。不同的冷冻保存技术具有不同的特点：颗粒法虽表面积容量大，易于冷冻保存，但其标识困难，难以辨认，不同颗粒之间容易交叉感染，这些缺点极大地限制了颗粒法的应用。0.25 mL 细管和0.5 mL 细管的表面积容量也很大，冷冻和解冻速度快，适合超低温冷冻保存。但单管精液的容量小，且每一次输精需要大量的精液，从而加大了授精人员的工作负担。5 mL 细管虽含有1 头份的精液量，但其表面积容量小，在冷冻和解冻的过程中，细管内部的精子受冷或受热不均匀，精子存活率较低。塑料袋法表面积容量大，且含有1 头份的精液量，可以说是其他冷冻方式优点的集合体，但由于塑料袋表面积大，难以在液氮中贮存而迟迟没有推广开来[10]。

1.5 解冻温度、速度、方法

解冻和冷冻一样， 只有使精子尽可能快地穿过危险温区（-60 ～0 ℃），才能提高精子的解冻成活率。解冻温度主要有0 ～5 ℃、30 ～40 ℃、50 ～70 ℃这3 种，细管型冻精最常用到的解冻方法是将细管置于35 ～40 ℃的温水中，待冻精融解到一半时取出备用。研究证明，0.25 mL 细管所储存的冻精在37 ℃温水中保持30 s，其解冻效果最好，精子成活率和顶体完整性最高[11]。而颗粒型冻精的解冻方法又分为干解冻法和湿解冻法，其中干解冻法是先将颗粒冻精放置于50 ～60 ℃水浴的灭菌容器中，然后放入解冻液，使其解冻。湿解冻法是先将解冻液放置于50 ～60 ℃的水浴的灭菌容器中，然后放入颗粒冻精，对比这两种解冻方法可知，除解冻液和颗粒冻精放置的先后顺序不同以外 ，其他操作过程并无差异[12]。

2 猪精液冷冻的损伤机理

2.1 物理损伤

在冷冻- 解冻的过程中，精液要经历由液态向玻璃态转变的过渡阶段，此时，稀释液中的水分和细胞内液两者形成的冰晶会刺伤精子质膜以及DNA 等内部结构，致使细胞器外露, 导致精子变性失活。

2.2 化学损伤

当温度降低，精子细胞外液会先形成冰晶，从而使细胞外液的渗透压升高，由于精子细胞内渗透压低，水由细胞内部的低渗溶液向细胞外的高渗溶液转移，从而导致精子细胞失水皱缩、蛋白质变性、质膜损坏，最终脱水死亡[13]。

2.3 自身氧化损伤

当温度大幅变化时，精子细胞会发生脂质过氧化反应，致使ROS动态平衡被打破，ROS 大量积聚，从而产生大量的脂类过氧化物，导致精子质膜破损，DNA 链断裂，核染色质损伤，精子呼吸被抑制, 蛋白质氧化损伤，精子畸形，精子成活率大大下降[14]。

3 结语

猪精液冷冻保存技术的出现具有跨时代的意义，这使得优良种公猪的精液可以在世界范围内传播，不再受时间和地域间的限制，同时节省接近90% 的种公猪，极大地降低了饲养成本，推动了种猪遗传育种和品种改良进程，为世界生猪产业提供更加优秀的种源。但目前猪精液冷冻保存技术尚未完全成熟，未来应着重于稀释液的开发，以及稀释液对精子毒副作用的研究。同时，应在分子层面上研究精子的损伤机理，找出各影响因素的最佳解决方案，最终提高猪精子冷冻后成活率和受精率，进一步推动养猪事业的蓬勃发展。