牛乳中主要过敏原致敏机理及其脱敏技术的研究进展

王佳蕊，李朝旭，李书国

（1河北科技大学生物科学与工程学院，石家庄050018，2河北三元食品有限公司，河北新乐050070）

0 引 言

牛奶富含蛋白质及多种矿物质，俗称“白色血液”，但它也是一类容易引起过敏的食物，在儿童中发病率大约为0.3%～7.5%，在成年人中的发病率则小于1%[1]。食物过敏是由某种食物或食品添加剂等引起的IgE介导和非IgE介导的免疫反应，可导致消化系统或全身性的变态反应。在婴幼儿成长阶段，母乳是其食物来源的最佳选择，但一些母亲由于身体状况无法正常提供母乳，所以奶粉就成为母乳唯一替代品。但是，近些年由于生活方式的改变、微生物的暴露、饮食习惯的改变等多种因素，婴幼儿的肠道免疫功能越来越低下，越来越多的婴幼儿患有牛乳蛋白过敏，这对他们的生活和家庭都带来极大的不便。

牛乳蛋白过敏(cow milk protein allergy，CMPA）是指由牛奶蛋白引起的异常或过强的免疫反应，母乳喂养的婴儿也可能发生牛奶蛋白过敏，是最普遍的一类食物过敏，发病率约为2%～7.5%[2]，主要存在于2岁以下的儿童中[3]。一般情况下，特应性皮炎是婴幼儿CMPA的主要表现形式。特应性皮炎是一种慢性反复，伴有瘙痒的皮肤病，荨麻疹为常见的表现形式。58%CMPA患儿可出现早期反应，表现为荨麻疹、血管性水肿、呕吐或急性特应性皮炎；42%的患儿会出现迟发性的胃肠道反应[4]，例如腹痛、腹泻等。这些症状极大影响了婴幼儿的营养吸收和生长发育，同时对家庭也造成了严重的困扰。目前对于这种症状还没有一套很完善的治疗方案，所以为了婴幼儿的健康成长，脱敏方法有待进一步提高，脱敏乳粉的开发也是迫在眉睫。

1 牛奶过敏原以及发病机理

能够引起食物过敏的物质叫做过敏原。食物中常见的过敏原大多都是蛋白质类物质，牛奶中含有超过20种的蛋白质，这些蛋白质都可能作为过敏原导致过敏反应[5]。目前，大多数牛乳过敏患者均是由特异性IgE介导的变态反应，一般要依次经历致敏阶段和效应阶段两个过程。当一种物质进入人体后，它通常会被降解，过敏原与抗原呈递细胞结合组成复合物，在过敏原刺激下，浆细胞产生大量过敏原特异性IgE抗体。过量的IgE能和一种含有多种过敏递质的肥大细胞结合，当再次接触到过敏原时，食物蛋白就会和附着在肥大细胞上的IgE发生反应，刺激肥大细胞释放出组织胺等化学物质，引起毛细血管扩张、血管壁通透性增强，引发过敏。

经研究表明，CMPA主要致病原因是由乳糖中的αs1-酪 蛋 白（αs1-casein，αs1-CN）、α-乳 白 蛋 白（α-lactalbumin，α-La）和β-乳球蛋白（β-lactoglobulin，β-Lg）作为常见过敏原而引起的[6]，这些蛋白都含有可以被免疫系统识别的抗原表位，包括构象表位和线性表位[7]。

1.1 αs1-酪蛋白

酪蛋白之所以是过敏原，是因为人乳与牛乳酪蛋白的组成和含量不同及其成分结构上的差异[8]。牛乳酪蛋白胶束粒子颗粒大，且沉淀时呈坚硬的凝块，而人乳中的酪蛋白胶束粒子较小，而且沉淀时呈极细微的分散状态。凝固性是由于牛乳中大量存在的αs-酪蛋白引起的，该物质在牛乳中占60%左右，其中80%是αs1-酪蛋白，但是人乳酪蛋白中几乎不含αs-酪蛋白。

αs1-酪蛋白是酪蛋白中最主要的一个过敏原，凡是对酪蛋白过敏的人，基本上都对αs1-酪蛋白过敏[9]。它是由分子间疏水相互作用形成非刚性三级结构，含有199个氨基酸，主要抗原表位在123～132，69～78[10]。

1.2 α-乳白蛋白

牛乳α-乳白蛋白是由123个氨基酸组成的球形单体蛋白[10]，与人乳α-乳白蛋白相比，有74%的氨基酸相同，另外有6%的氨基酸残基化学性质相似，但目前也是公认的引发牛乳过敏的主要过敏原之一，这表明其构象表位是牛乳过敏的主要原因[11]。已有研究表明，有75%的牛乳过敏患者血清中含有α-乳白蛋白的特异性抗体[12]，其主要抗原表位在42～49，60～80，91～96。

1.3 β-乳球蛋白

β-乳球蛋白含有162个氨基酸残基，存在形式与pH值有关，在鲜牛乳中通常是二聚体形式存在[10]。由于人乳中不含有β-乳球蛋白，因此它被认为是最主要的牛乳过敏原蛋白之一。另有研究证明，82%的牛乳过敏患者对牛乳β-乳球蛋白过敏[13]，其主要抗原表位在41～60，102～124，149～162。

2 食物脱敏的方法

在食品加工过程中，有许多可以降低或者去除过敏原的方法[14]。根据食物不同的过敏机理、过敏原的一些结构与性质，国内外普遍采用的脱敏方法有三种：物理、化学和生物学方法。物理方法主要包括热处理、辐照处理以及高静水压处理；化学方法主要是糖基化修饰；生物学方法主要有发酵法、基因工程法和酶法。

2.1 物理方法

2.1.1 热处理

蛋白质变性是结构构象发生改变，一般是二、三、四级结构的变化。热处理可导致蛋白质的变性，导致构象产生不可逆的变化，从而影响其物理化学性质。热处理可以将许多蛋白质分子中的作用键打开，将被卷曲的肽链释放出来，可加速蛋白酶的水解和消化酶的分解[15]，并且有利于降低蛋白的致敏性。由于过敏反应中B细胞的抗原决定部位取决于其构象和抗原的三级结构，因此热变性主要改变B细胞的过敏反应模式[16]。

Bu等[17]研究了牛乳过敏原β-Lg的热诱导抗原性变化，结果表明加热至90℃时会导致β-Lg分子展开、构象表位暴露，对蛋白水解的敏感性增强，从而导致过敏反应的增加。但是进一步升高温度至100℃和120℃可掩饰或者破坏构象表位并降低变应原性。这种热诱导的变化显示出对消化性水解的更高敏感性[18]。蛋清可以作为婴幼儿优良食品之一，但同时也是食物过敏原之一。Lechevalier等[19]对蛋清粉在70°C下2-5 d或80～90°C下1-2 d进行干热处理，结果表明干燥加热也会改变卵白蛋白构象，降低抗原性和免疫原性，同时还改善了蛋清的起泡性和凝胶性等功能特性。除此之外，Sanchiz等[20]采用湿热结合高压的方法研究了对腰果和开心果IgE反应性的影响，在2.56 ATM，138°C条件下处理这两种树坚果30 min，结果表明与未处理的腰果相比，交联IgE和嗜碱性粒细胞的能力显著降低了，明显降低了过敏性。这一系列研究表明，热处理可以改变致敏蛋白的结构性质从而在一定范围内降低食物的致敏性，但具体在实际生产中的应用效果还需要进一步研究。

2.1.2 辐照处理

食品辐照技术是使用电离辐射源60Co或137Cs产生的γ射线、机械源产的X射线或电子束对将包装或散装食品置于受控水平下电离辐射一定时间的处理过程[21]。辐照技术其实就是利用射线与物质间的作用，电离和激发产生的活化原子、活化分子与物质发生一系列物理、化学、和生物化学变化，导致物质的降解、聚合、交联、并发生改性。有研究表明经处理后蛋白质分子会发生脱氨、脱羧、氨基酸氧化、二硫键断裂或重建、肽链的降解或交联等一系列的反应[22-23]，改变蛋白分子原有的性质，进而达到降敏的效果。

辐照处理在牛奶中研究较少，但在其他食物脱敏方面应用广泛。Luo等[24]选用1、3、5或10 k Gy剂量辐照花生全蛋白提取物，结果表明辐照使花生过敏原Ara h 6的二级和三级结构发生显著变化，随着辐照剂量的增加，花生全蛋白提取物的抗原性有所降低。Gomaa[25]等研究了γ射线辐照和热处理对面包、煮面条和膨化谷物的回收率影响，结果表明γ射线辐照可能影响低水平致敏食品残留的抗原性，不过这也取决于食品基质和加工方法。综上考虑，辐照处理在乳制品脱敏方面需要更加深入研究，并且其安全性也有待考察。

2.1.3 高静压处理（High hydrostatic pressure，HHP）

在一个压力条件下维持一定时间的称作静压力，食品加工应用中的一般压力范围在100～1 000 MPa[26]。高静压技术是一种新兴的食品工业非热技术，可以抑制微生物的生长，延长食品的货架期，但不影响食品感官特性。高压处理蛋白质主要通过三条途径降低其致敏性，一是高压诱导蛋白质聚合，从而掩饰或破坏表位；二是通过提取来去除过敏原；三是压力诱导蛋白展开使蛋白酶在其中作用达到降敏效果。其实主要是影响蛋白质分子中的非共价的相互作用，例如氢键、离子键和疏水键，从而影响二级和三级结构，达到调节其消化率和变应原性效果[27]。

Hu等[28]使用HHP多循环装置处理密封在聚乙烯塑料袋中α-氯化萘样品，以未加压α-氯化萘为对照，结果表明HHP处理的α-酪蛋白组表现出不同程度的降解，这可能与特征结构域的破坏以及构象的改变有关。Yang等[29]研究了高压结合热处理对核桃免疫反应的影响，在650 MPa、100℃下处理15 min后，IgE结合能力大幅下降，同时表征了加工核桃对BALB/c小鼠过敏模型的影响，其血清特异性IgE结合能力和组胺水平分别下降41.04%和19.76%，表明小鼠过敏反应的临床症状明显减轻。结果表明HHP和热处理联合应用可能是减少食物过敏原的一种潜在策略。

2.2 化学方法

糖基化修饰是将碳水化合物以共价键与蛋白质分子上的氨基相连接而形成糖基化蛋白的化学反应[16]，又称美拉德反应。糖基化过程诱导变应原蛋白发生可逆或不可逆的结构修饰，导致蛋白变性、聚集，从而食物蛋白的过敏行为可能被减弱，最终降低其致敏性。除此之外，糖化反应可产生高级糖化终产物，其可消除抗原呈递细胞的抗原性，并因此抑制过敏反应[30]。

田明等[31]用高压脉冲电场和糖基化复合处理β-Lg，结果表明自由基含量显著下降，β-Lg的表位被遮盖，并且在15 kv/cm下在进行糖基化处理，降敏性程度最大。Gupta等[32]研究了糖化对食物蛋白致敏性的影响，将鹰嘴豆蛋白纯化，随后再将该纯化蛋白糖化，与天然蛋白处理相比，结果表明在糖化蛋白处理的小鼠中，暴露的脾细胞中产生的Th1多于Th2，显然鹰嘴豆过敏原的糖基化显著降低了小鼠的致敏潜能和过敏反应，并且这项研究可能对临床有益。

2.3 生物学方法

2.3.1 微生物法

肠道菌群失衡的人群更容易食物过敏，婴幼儿的过敏症状主要也是由于肠道菌群失调引起的。有研究表明过敏婴幼儿与非过敏婴幼儿相比，肠道乳酸杆菌、双歧杆菌定植较少[33]。因此，肠道环境对食物过敏的形成起重要作用，肠道微生物的稳定对免疫系统的成熟有着重要的作用。所以，乳酸发酵可以作为降低牛乳蛋白过敏的一种方法。

Pescuma等[34]选取保加利亚乳杆菌CRL 656降解β-Lg，结果表明乳杆菌细胞包膜蛋白酶能够在体外降解β-Lg及其表位，降低人体内血清对该蛋白的过敏反应。Shi等[35]研究了干酪乳杆菌发酵对α-La、β-Lg、α-酪蛋白和β-酪蛋白抗原性和残留致敏性的影响，结果表明发酵后明显降低了4种乳蛋白的抗原性和致敏性。由此可见，微生物法可有效降低食物的致敏性，目前也受到越来越多人的关注，但微生物发酵抗过敏机制尚未十分清楚，特别是对降低致敏蛋白过敏性的效果尚没有明确的结论[36]。

2.3.2 酶解

大部分食物过敏原都是蛋白质，蛋白酶催化蛋白质具有表位的片段，进行水解可显著降低蛋白质抗原性，防止蛋白质类过敏的发生[27]。牛乳中主要是以酪蛋白、乳清蛋白为主的过敏原，将其水解为没有过敏性的小分子乳蛋白、乳蛋白肽或者氨基酸，从而降低牛乳的过敏性。

Damodaran等[37]用两步酶法影响乳蛋白的免疫反应性，用嗜热菌蛋白酶、胰蛋白酶或胰凝乳蛋白酶进行初始部分水解，随后使用谷氨酰胺转胺酶使水解产物再聚合。结果表明嗜热菌蛋白酶是破坏乳清蛋白中变应原表位最有效的蛋白酶，并且免疫原性大幅下降，即两步酶促修饰方法可以生产低变应原性乳蛋白质产品。Villas-Boas等[38]模拟胃肠道消化的抗性β-Lg进行两步酶促修饰，研究了碱性蛋白酶和菠萝蛋白酶水解β-Lg及其与转谷氨酰胺酶聚合反应对蛋白质抗原性的影响，结果表明碱性蛋白酶水解比菠萝蛋白酶水解能更有效地裂解β-Lg表位，降低IgE结合反应。通过研究得到适当酶解可以改变乳蛋白性质，降低IgE的结合能力，从而达到牛乳脱敏的效果，这项研究对CMPA患儿有一定的帮助。

除此之外，酶解在其他具有过敏原的食物中也有降敏作用。Meinlschmidt等[39]也采用食品级蛋白酶对大豆分离蛋白中主要过敏原进行酶辅助还原，结果表明碱性蛋白酶、胃蛋白酶和木瓜蛋白酶的水解活性分别为100%、100%和95.9%，这3种酶对大豆主要过敏原的降解效果最好。Ambrosi等[40]将HHP与酶水解方法结合处理乳清蛋白浓缩物，在不同压力水平和时间下进酶解，观察其蛋白质致敏性，结果表明当这两种方法结合使用时，水解度随着施加的压力水平和处理时间增大而增大，影响蛋白质的致敏力。从该实验中又能得到单独使用HHP对蛋白质抗原性没有显著影响，但结合酶法，随着压力增大蛋白质解折叠最大化，蛋白质暴露于蛋白水解酶的攻击，使之变性诱导肽键断裂，从而影响其抗原力。酶水解可以作为降低变应原性水平的有效途径，但是酶解可以将蛋白质水解为没有致敏性的氨基酸，达到完全脱敏的效果，但若进行部分水解为混合肽，还是存在潜在的过敏性。目前来看酶法结合其它脱敏方法降敏的效果可能更加显著，但能够完全脱敏的方法还是很少，还需要我们进一步研究。

3 国内外抗过敏乳粉的应用现状

目前国内外大多都是用酶解方法来缓解婴幼儿牛奶过敏症状，基本大多选用水解配方奶粉代替普通奶粉进行喂养。根据水解程度的不同，有深度水解产品、部分水解产品和轻度水解产品。国外有推荐深度水解配方奶粉作为婴儿病例的替代品，然而该配方奶不仅被反映口感较差，而且有研究表明出现了营养问题，如婴幼儿生长减少，血浆蛋白浓度和铁结合能力降低，血浆和尿液中某些氨基酸浓度失衡等问题[41]。

目前部分水解牛奶配方奶对患有轻中度特应性皮炎的婴儿具有明显的治疗效果。Jin等[42]研究了大多数CMPA患者是否能摄入水解配方的奶粉，对53例患有牛奶过敏的儿童每20 min进行一次口服激发试验，即连续摄入8 mL/kg体重的部分水解配方乳粉，统计分析得到有40名儿童没有任何不良反应，结果表明早期和长期施用部分水解配方乳粉可以有利于诱导牛奶过敏患儿对牛奶抗原的免疫耐受。Bhanegaokar等[43]研究了益生菌鼠李糖乳杆菌GG(Lactobacillus rhamnosus GG，LGG)的广泛水解酪蛋白配方（extensively hydrolyzed casein formula，EHCF）是否可以减少牛奶过敏患儿其他过敏表现的发生。结果表明EHCF+LGG配方降低了其他过敏表现的发病率，加速了IgE介导CMPA患儿口服耐受的发生，这表明微生物法与酶解法联合脱敏效果显著。张菊弟等[44]选取98例牛奶蛋白过敏性哮喘患儿进行人工喂养深度水解配方奶粉12周，结果表明体重指数和IgE相比治疗前分别有明显的提高和下降。该配方奶粉治疗过敏性哮喘效果显著，可用于临床医学的推广。邹素娟等[45]将50例牛奶蛋白过敏性腹泻患儿一半摄入游离氨基酸配方奶粉，一般摄入深度配方水解奶粉，观察患儿腹泻次数、大便性状等，结果得到深度配方奶粉治疗腹泻的总有效率可达100%。综上所述，酶解方法应用于牛乳脱敏较普遍，大多数水解配方奶粉可以缓解牛奶过敏症状，但还需要进一步研究保证最大限度的脱敏以及改善产品的口感。

目前国外的雀巢、雅培和美赞臣都注册了水解配方奶粉。雀巢推出的深度水解恩敏舒和部分水解肽敏舒系列产品，以及美赞臣研发的安敏健，都是针对CMPA患儿开发的无过敏性或低过敏性的配方乳粉。我国是近几年才开始着重研究水解配方乳粉对婴幼儿的影响，不过目前我国在抗过敏奶粉方面还是零产品，与国外差距甚大。

4 结论与展望

牛乳过敏是全世界普遍关注的食品安全问题，它不仅影响婴幼儿生长发育，而且对家庭无疑也是一种负担，所以目前功能性乳制品的开发迫在眉睫，我们必须重视该问题，并深入探究过敏机理以及脱敏方法。

关于乳制品的降敏技术，物理和化学脱敏主要是改变蛋白的结构特性，在一定程度上降低牛乳过敏性，但能否可以应用到实际生产中还有待研究；微生物法是当下脱敏技术的一个新的选择，不影响牛乳本身的营养价值与风味，具有潜在的应用前景；酶解可以最大限度降敏甚至完全脱敏，但是口感方面可能会有所欠缺。目前已知的深度水解配方将蛋白质水解为氨基酸，虽然没有致敏性但是口感和功能特性上远不如部分水解配方奶粉。部分水解不仅能降敏，还能释放出小分子量功能肽，可以改善婴幼儿睡眠质量并提高免疫力。综合考虑，在降低牛乳蛋白过敏方面，部分水解蛋白和微生物发酵都是不错的方法。除此之外，也可以考虑多种方法联合降敏，这就需要我们进一步在理论和实际应用方面研究，相信未来的技术越来越先进，产品无论在口感还是疗效，都将会有重大突破。