羔羊大肠杆菌性腹泻快速检测与敏感药物筛选

宋晓莉，成大荣，刘晓明，吴 悠，肖宜容，沈若子

（扬州大学兽医学院，江苏 扬州 225009）

关键字：羔羊腹泻；快速检测；药敏试验

近年来，随着人们对食品质量要求的提高，以“高蛋白、低脂肪、低胆固醇”著称的羊肉越来越多地受到消费者的青睐，羊肉需求量的激增为我国肉羊产业的发展提供了机遇[1]。然而，肉羊疫病并没有因为羊场规模化程度的提高而降低。羊大肠杆菌病的病原为“致病性大肠杆菌”，是规模肉羊场最为常见高发的细菌性疾病之一[2]。该病主要危害幼羊，生后数日至6周多发，有些地方3～8月龄的羊也有发生[3]，是一种会引起羊腹泻和败血症的急性致死性传染病。羔羊的大肠杆菌并死亡率极高，对养殖业有很大的危害。目前，对该病的治疗主要依靠一些抗菌药物，尤其是抗生素，从而导致了临床上的耐药菌株越来越多，并且不断产生了许多新的耐药菌株，从而使临床上有时应用抗生素治疗的效果很差[4]。本试验中对发病羔羊采集肛拭子增菌后进行快速药敏试验，选取敏感药物治疗用于临床快速治疗，同时进行了大肠杆菌毒力基因的快速检测，明确了其毒力因子，达到了快速诊断与治疗的目的。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 大肠杆菌来源 2018年4月份，采集江苏省海门市某规模化羊场羔羊腹泻病例肛拭子10份。

1.1.2 试剂 LB液体培养基（胰蛋白胨1%、酵母抽提物0.5%、氯化钠1%）；PCR试剂盒和DL-1000 Marker均购自宝生物工程有限公司；普通肉汤培养基购自青岛海博生物技术有限公司；优质琼脂糖购自西班牙Bio-west；强力霉素、新霉素、庆大霉素、磷霉素、头孢曲松、氨苄西林、阿米卡星、复方新诺明、四环素、环丙沙星、阿莫西林、多粘菌素B、卡那霉素药敏纸片购自杭州滨和微生物试剂有限公司等。

1.1.3 仪器与设备 净化工作台（上海新苗医疗器械制造有限公司产品，型号为SW-CJ-1F）、摇床（INCUBATOR SHAKER公司产品，型号为IS-RDS3）、台式冷冻离心机（上海安亭科学仪器厂产品，型号为TGL-16B）、PCR基因扩增仪（Applied Bio-systems公司产品，型号为9902）、电泳仪（北京市六一仪器厂产品，型号为DDY-6C型）、凝胶成像系统（上海天能科技有限公司产品，型号为Tanon-2500）等。

1.2 PCR引物参照成大荣[5（]表1）文献的引物，由上海生物工程技术服务有限公司合成。

1.3 方法

1.3.1 参考菌株来源及复苏 大肠杆菌K88（C83600株）、K99（C83921株）、987P（987株）、F41（B41株）、F18（fed-A）（12F 株、8813 株）、HPI（irp 2）、LEE（eae）（S452631株）、ST1（C83912株）、ST2+LT1（C83600株）、Stx1（H30株）、Stx2（933W株）、Stx2e（YCED1株）、沙门氏菌（ATCC25923株）、葡萄球菌（ATCC26003株）参考菌株均为本实验室分离鉴定并保存。冻存菌株解冻后吸取50 μL于5 mL已加入10%小牛血清的LB液体培养基中，37℃，16 h。

1.3.2 样品的采集及增菌培养 对10份肛拭子其进行增菌培养，培养时将肛拭子放入用5 mL已加入10%小牛血清的LB液体培养基于试管中，37℃摇床增菌培养16 h，待检测致病性大肠杆菌。

1.3.3 细菌DNA模板的制备 运用煮沸法[6]提取细菌的DNA模板：吸取液体培养物0.8 mL于微量离心管中，4℃、12 000 r/min离心5 min；弃去上清液，重新悬浮于1 mL的超纯水中，4℃、12 000 r/min离心5 min；再次弃去上清液，重新悬浮于200 μL的超纯水中；100℃水浴10 min；冰浴5 min；4℃、10 000 r/min离心10 min；吸取上清液即为制备好的细菌DNA模板，转移至新的微量离心管中，4℃备用。

1.3.4 样品的快速检测

1.3.4.1 羔羊腹泻源大肠杆菌菌毛基因的检测 用多重PCR方法对K88、F41、K99、987P菌毛基因进行扩增。取待检测DNA为模板，扩增K88的引物为K88-1、K88-1/F41-1，扩增F41菌毛基因的引物为F41-1、F41-2，扩增K99菌毛基因的引物为K99-1、K99-2，扩增987P菌毛基因的引物为987P-1、987P-2，各引物浓度为50 μmol/L(表1）。PCR的体系为：细菌DNA模板取2 μL、Primer-F取0.5 μL、Primer-R取0.5 μL、Premix Taq取10 μL，将以上加入到已灭菌0.5 mL的PCR管中，再加入7 μL无菌水至整个体系为20 μL。PCR反应程序为：94℃ 3 min，（94℃ 30 s，56℃ 30 s，72℃ 1 min）每2个循环降低1℃，共8个循环，（94℃ 30 s，52℃30 s，72℃ 1 min）共24个循环，72℃ 10 min，4℃。

用PCR方法对F18菌毛基因进行检测。扩增F18菌毛fedA特异性片段的引物为fedA-1、fedA-2，PCR体系同上。PCR反应程序为：94℃ 3 min，（94℃ 30 s，66℃ 30 s，72℃ 1 min）每2个循环降低1℃，共8个循环，（94℃ 30 s，52℃30 s，72℃ 1 min）共24个循环，72℃ 10 min，4℃。

1.3.4.2 羔羊腹泻源大肠杆菌LEE毒力岛和HPI毒力岛的检测 用双重PCR方法对LEE毒力岛和HPI毒力岛进行扩增。取待检测DNA为模板，扩增LEE毒力岛的引物为LEE-F、LEE-R，扩增HPI毒力岛的引物为HPI-F、HPI-R，各引物浓度为50 μmol/L（表1），按以下反应体系进行PCR扩增。

细菌DNA模板取2 μL、4个引物各取0.5 μL、Premix Taq取10 μL，将以上加入到已灭菌0.5 mL的PCR管中，再加入6 μL无菌水至整个体系为20 μL。

表1 扩增K88、K99、987P、F41、F18（fed-A）、HPI（irp 2）、LEE（eae）、ST1、ST2、LT1、Stx1、Syx2/Stx2e基因片段的引物序列Table 1 Amplification of K88,K99,987P,F41,F18(fed-A),HPI(irp 2),Primer sequences of LEE(eae),ST1,ST2,LT1,Stx1,Syx2/Stx2e gene fragments

PCR反应程序为：94℃ 3 min，（94℃ 30 s，58℃ 30 s，72℃ 1 min）共30个循环，72℃10 min，4℃。

1.3.4.3 羔羊腹泻源大肠杆菌毒素的检测 用多重PCR方法对大肠杆菌毒素、LT1、ST-1、ST-2、Stx1、VT2all（Stx2、Stx2e）进行扩增。取待检测DNA为模板，扩增LT1-1的引物为LT1-F、LT1-R，扩增st1的引物为ST1-F、ST1-R，扩增St2的引物为ST2-F、ST2-R，扩增Stx1的引物为VT1-1、VT1-2，同时扩增Stx2+Stx2e的引物为VT2all-F、VT2all-R。各引物浓度为50 μmol/L（表1），按以下反应体系进行PCR扩增。

细菌DNA模板取2 μL、Primer-F取0.5 μL、Primer-R 取 0.5 μL、Premix Taq取 10 μL，将以上加入到已灭菌0.5 mL的PCR管中，再加入7 μL无菌水至整个体系为20 μL。

PCR反应程序为：94℃ 3 min，（94℃ 30 s，60℃ 30 s，72℃ 1 min）每2个循环降低1℃，共8个循环，（94℃ 30 s，56℃ 30 s，72℃1 min）共24个循环，72℃ 10 min，4℃。

1.3.4.4 PCR产物的琼脂糖凝胶电泳 取PCR扩增产物5 μL进行1%琼脂糖凝胶电泳，以DNA Marker DL 2000为参照，观察扩增片段大小。

1.3.5 快速药敏试验 将10份肛拭子放置于营养肉汤培养基，37℃培养6 h，经与浊度管（0.5麦氏单位比浊管）比较，浊度一致。用灭菌的棉签蘸取少量的菌液，以不下滴液为宜，均匀涂布于平板上，待干后（5 min），用灭菌镊子分别取药敏纸片均匀贴于培养基表面（纸片距平板边缘10～15 mm，纸片间距、纸片距平板中心一般控制在24 mm为宜），并用镊子轻按纸片中心，使其附着严密。将平板倒置，37℃培养16 h后取出平板，用测定器具测量抑菌圈直径，判断出该菌对测试纸片的敏感度。判定标准依据杭州滨和微生物试剂有限公司产品使用说明书。

2 结果与分析

2.1 羔羊腹泻源大肠杆菌菌毛基因的检测

2.1.1 Multiplex-PCR扩增K88、F41、K99、987P菌毛基因的特异性 通过对大肠杆菌K88（C83600株）、K99（C83921株）、987P（987株）参考菌株和沙门氏菌（ATCC25923株）、葡萄球菌（ATCC26003株）阴性对照的扩增，结果表明大肠杆菌K88（C83600株）、K99（C83921株）、987P（987株）均能扩增到预期约841、543和463 bp片段，分别与期望片段大小一致，而沙门氏菌（ATCC25923株）、葡萄球菌（ATCC26003株）不能扩增到期望的片段。这表明此方法可以特异性检测K88、F41、K99、987P菌毛基因。见图1。

图1 Multiplex-PCR检测K88（841 bp）、F41（628 bp）、K99（543 bp）、987P（463 bp）特异性片段Fig.1 Multiplex-PCR detection of K88,F41,K99,987P specific fragments

2.1.2 PCR鉴定F18菌毛基因的特异性 通过对大肠杆菌F18（fed-A）参考菌株和沙门氏菌（ATCC25923株）、葡萄球菌（ATCC26003株）阴性对照的扩增，结果表明大肠杆菌F18（fed-A）均能扩增到预期约513 bp片段，分别与期望片段大小一致，而沙门氏菌（ATCC25923株）、葡萄球菌（ATCC26003株）不能扩增到期望的片段。这表明此方法可以特异性检测F18菌毛基因。见图2。

图2 PCR检测F18（513 bp）特异性片段Fig.2 PCR detection of F18(513 bp)specific fragments

2.2 羔羊腹泻源源大肠杆菌毒素基因的检测

2.2.1 Multiplex-PCR 检 测 Stx1、 Stx2+2e、 ST2、LT1、ST1毒素基因特异性片段 通过对大肠杆菌Stx1（H30 株）、Stx2（933W 株）+Stx2e（YCED1 株）、ST2+LT1（C83600株）、ST1（C83912株）参考菌株和沙门氏菌（ATCC25923株）、葡萄球菌（ATCC26003株）阴性对照的扩增，结果表明大肠杆菌Stx1（H30株）、Stx2（933W株）+Stx2e（YCED1株）、ST2+LT1（C83600株）和ST1（C83912株）均能扩增到预期约664、484、360、282和183 bp片段，分别与期望片段大小一致，而沙门氏菌（ATCC25923株）、葡萄球菌（ATCC26003株）不能扩增到期望的片段。这表明此方法可以特异性检测Stx1、Stx2+2e、ST2、LT1、ST1毒素基因。见图3。

图3 Multiplex-PCR检测Stx1（664 bp）、Stx2+2e（484 bp）、St2（360 bp）、Lt1（282 bp）、ST1（183 bp）特异性片段Fig.3 Multiplex-PCR detection of Stx1,Stx2+2e,St2,LT1,ST1 specific fragments

2.2.2 Duplex-PCR检测Stx2e、stx2毒素基因特异性片段 通过对大肠杆菌Stx2（933W株）、Stx2e（YCED1株）参考菌株和沙门氏菌（ATCC25923株）、葡萄球菌（ATCC26003株）阴性对照的扩增，结果表明大肠杆菌Stx2（933W株）+Stx2e（YCED1株）均能扩增到预期约454 bp、281 bp片段，分别与期望片段大小一致，而沙门氏菌（ATCC25923株）、葡萄球菌（ATCC26003株）不能扩增到期望的片段。这表明此方法可以特异性检测Stx2e、Stx2毒素基因。见图4。

图4 Duplex-PCR检测Stx2e（454 bp）、Stx2（281 bp）特异性片段Fig.4 Detection of Stx2e(454 bp)and Stx2(281 bp)specific fragments by Duplex-PCR

2.3 Duplex-PCR检测LEE（eaeA）毒力岛和HPI（irp2）毒力岛特异性片段通过对大肠杆菌HPI（irp 2）、LEE（eae）（S452631株）参考菌株和沙门氏菌（ATCC25923株）、葡萄球菌（ATCC26003株）阴性对照的扩增，结果表明大肠杆菌HPI（irp 2）、LEE（eae）（S452631株）均能扩增到预期约425 bp、280 bp片段，分别与期望片段大小一致，而沙门氏菌（ATCC25923株）、葡萄球菌（ATCC26003株）不能扩增到期望的片段。这表明此方法可以特异性检测LEE（eaeA）毒力岛和HPI（irp2）毒力岛特异性基因。见图5。

图5 Duplex-PCR检测LEE（eaeA）425 bp、HPI（irp2）280 bp特异性片段Fig.5 Detection of LEE(eaeA)425 bp and HPI(irp2)280 bp by Duplex-PCR Specific fragment

表210 份样品中K88、K99、987P、F41、F18（fed-A）、HPI（irp 2）、LEE（eae）、ST1、ST2、LT1、Stx1、Stx2、Stx2e阳性率分析Table 2 Analysis of positive rates of K88,K99,987P,F41,F18(fed-A),HPI(irp 2),LEE(eae),ST1,ST2,LT1,Stx1,Stx2,Stx2e in 10 samples

2.4 样品的快速检测结果与分析结果见表2。在2018年4月被检测的10份样品中，未检测出带有K99、987P、F18菌毛基因的大肠杆菌。检测出带有K88菌毛基因的大肠杆菌1份，检出率为10%，检测出带有F41菌毛基因的大肠杆菌2份，检出率为20%。检测出带有HPI毒力岛基因的大肠杆菌5份，检出率为50%，检测出带有LEE毒力岛基因的大肠杆菌2份，检出率为20%，未检测出带有ST1、ST2、Stx2、Stx2e毒素基因的大肠杆菌，检测出带有Stx1毒素基因的大肠杆菌5份，检出率为50%。

同时带有LEE与HPI毒力岛的样品共2份，同时带有HPI毒力岛与Stx1毒素的共有3份，同时带有LEE毒力岛与Stx1毒素的共1份样品，同时带有Stx1，HPI与LEE毒力岛基因的样品只有2份，同时带有HPI毒力岛、F41菌毛、Stx1毒素基因的样品共2份。

表3 10份样品药敏试验分析Table 3 Analysis of rapid susceptibility test of 10 samples

2.5 药敏试验将10份样品进行了13种抗生素的药敏试验。检测结果表明，样品对磷霉素、头孢曲松、氨苄西林、环丙沙星、多粘菌素B比较敏感，敏感比率为100%；耐药性最强的是强力霉素，耐药比率为100%，其次是新霉素，耐药比率为30%。见表3。

3 讨论

大肠杆菌病是羊养殖生产过程中常见的一种细菌性传染病，在大多数国家均普遍流行，发病率在细菌病引起的疾病中居世界首位[7]，给养羊业造成巨大的经济损失[8]。近几年来，人们对畜禽产品的需求量逐渐增加，一方面，经营者为了能够满足市场需求而迅速扩大规模；另一方面，饲养管理水平不能满足规模化养殖的需求，疾病频发，为了获得较高的经济利润，为了控制大肠杆菌病和某些细菌的感染，在饲料中添加或在治疗中盲目使用抗菌药物，导致大肠杆菌的耐药菌株越来越多，耐药性也越来越严重[9-10]。但是此病目前主要通过使用抗生素来治疗，造成了抗生素的滥用，快速检测与敏感药物的筛选减少了抗生素的过度使用，同时节约了治疗时间，减少了发病羊群的死亡率[11-14]。可有选择性地指导用药，提高了治疗效率，也减少了治疗成本。

传统的检测方法是直接将病料处理，进行细菌的分离鉴定费时费力、检出率低、特异性差。PCR方法具有快速诊断、节省时间、降低成本、特异性好、效率高等优点［15-19］。药敏试验可以迅速选择有效药物，选择敏感药物是治疗本病的关键［20-22］。

本试验研究的意义在于，第一，通过对羔羊腹泻源致病性大肠杆菌毒力因子的检测，掌握羊源致病性大肠杆菌的流行情况，完善了流行病学数据；第二，药敏试验快速筛选出敏感药物，快速有效地对症治疗，减少了抗生素的滥用，节约了治疗成本；第三，快速检测结果与快速药敏试验筛选数据，为羔羊腹泻爆发和防控提供了参考，对致病性大肠杆菌的预警、制定科学措施防控好致病性大肠杆菌具有指导的意义。