山羊伪结核棒状杆菌PMA-PCR检测方法的建立

许国洋，付利芝，龙小飞 ，陈朝洪，李鹏飞，张素辉 ⋆

（1.重庆市畜牧科学院，重庆 402460；2.重庆市武隆区畜牧兽医局，重庆 408500；3.贵州大学，贵州 贵阳 550000）

伪结核棒状杆菌（Corynebacterium pseudotuberculosis）是引起干酪性淋巴结炎的主要病原菌，能使绵羊、山羊、骆驼等多种动物发病的人兽共患病[1]。近年来，我国许多省份或地区的山羊均有不同程度感染此病，部分地区甚至发病率超过80%，对山羊健康养殖造成严重危害[2]。因此，开展伪结核棒状杆菌的检测及防控技术研究十分必要。叠氮嗅化丙锭（PMA）是一种DNA染料，能够进入破损细胞膜，与DNA选择性共价交联结合，在可见光（吸收峰460 nm）的照射下，PMA可修饰DNA分子，阻碍交联DNA的PCR扩增，而PMA不会与活菌DNA结合，不会影响活菌的PCR鉴定，目前，PMA已被广泛应用于多种活菌的检测中[3]。高达芳等[4]将PMA与PCR技术相结合，建立了马铃薯青枯病病菌的活菌检测方法，并成功对临床样品中的活菌进行了检测。张晶等[5]将PMA与RTi-PCR技术相结合，成功建立了一种快速准确的创伤弧菌检测方法。由于伪结核棒状杆菌对培养条件要求较高，通过传统微生物培养方法来鉴定样品中的伪结核棒状菌，常出现漏检[6-7]。而直接对样品进行分子鉴定时，又可能受到死菌干扰，造成检测结果的误判，可能造成药物的浪费。此外，针对伪结核棒状杆菌活菌检测的方法相对较少。基于此，本研究将PMA与PCR技术相结合，建立了伪结核棒状杆菌的活菌PMA-PCR检测方法，为伪结核棒状杆菌的死活鉴定提供理论依据，也给该病的防控奠定了一定的基础。

1 材料与方法

1.1 菌株伪结核棒状杆菌、链球菌、多杀性巴氏杆菌、大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌由重庆市畜牧科学院兽医兽药研究所保存。

1.2 试剂PMA试剂购自美国Biotium公司；细菌基因组DNA提取试剂盒购自TIANGEN（北京）有限公司；胎牛血清（FBS）购自Gibco有限公司；PCR Master Mix（2×）、DNA Marker DL 2000等试剂购自宝生物工程（大连）有限公司；500W卤素灯（型号：QVF135，购自Philips公司）。

1.3 引物设计及PCR扩增根据Genbank中伪结核棒状杆菌的磷脂酶D基因序列设计特异性引物F/R，序列信息为：F：5’-GTGAGAAGAACCCCGGTATAAG-3’；R：5’-TACCGCACTTATTCTG ACA C TG-3’，产物大小为291 bp。引物由生工生物公司（上海）有限公司合成。PCR反应体系25 μL：12.5 μL 2 ×Taq Mix，上、下游引物（10 μm）各0.5 μL，DNA模板2 μL，灭菌ddH2O补至25 μL。PCR反应条件：94℃预变性5 min；94℃变性45 s，55℃退火45 s，72℃延伸45 s，30个循环；72℃终延伸10 min。PCR产物经1%琼脂糖凝胶电泳鉴定，并送生工生物公司（上海）有限公司测序。

1.4 最佳灭活温度的筛选取4 mL伪结核棒状杆菌液（1×108cfu/mL）分别装于4支1.5 mL离心管中，置于60、70、80、90℃水浴中灭活10 min后冷却至室温，吸取0.2 mL菌液涂布于胎牛血清培养基上，37℃下培养36～48 h，观察是否有菌落长出并计数。

1.5 PMA-PCR最佳曝光时间优化取4 mL灭活伪结核棒状杆菌液（1×108cfu/mL）分别装于4支1.5 mL离心管中，分别加入终浓度为20 μm的PMA，振荡混匀，置于黑暗处孵育10 min，在距离500 W氯素灯20 cm处，分别曝光5、10、15、20 min，每隔2～3 min，进行震荡混匀。并设不加PMA的灭活菌液作为阳性对照，ddH2O作为阴性对照，光照交联后，提取各组处理后的菌液基因组进行PCR扩增，确定最适曝光时间。

1.6 PMA最适浓度优化取6 mL热灭活伪结核棒状杆菌悬液（1×108cfu/mL）分别置于6支1.5 mL离心管中，分别加入终浓度为1、5、10、15、20、25 μmol/L的PMA溶液，振荡混匀，避光孵育10 min后，以最佳曝光时间进行光照交联，提取各组处理后的菌液基因组进行PCR扩增，确定能够完全抑制热灭活伪结核棒状杆菌PCR扩增的最小PMA浓度。同时，以热灭活后不加PMA作为阳性对照，ddH2O作为阴性对照。另取6 mL伪结核棒状杆菌活菌悬液（1×108cfu/mL）置于6支1.5 mL离心管中，分别加入终浓度为 15、20、25、30、40、45、50 μmol/L的PMA溶液，参照上述方法，确定不抑制伪结核棒状杆菌活菌PCR扩增的最大PMA浓度。同时，以活细菌不加PMA作为阳性对照，ddH2O作为阴性对照。

1.7 PMA-PCR 特异性分析分别取伪结核棒状杆菌、链球菌、多杀性巴氏杆菌、大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌和沙门氏菌悬液1 mL，提取基因组，进行PMA-PCR扩增，分析该方法的特异性。

1.8 PMA 对不同比例活菌/死菌的样品检测效果按照表1制备不同浓度的活菌与死菌悬液，各取500 μL，充分混匀后，提取基因组，以最适反应条件进行PMA-PCR扩增。同时，以不加PMA作为阳性对照，ddH2O作为阴性对照。

表1 死和活伪结核棒状杆菌液混合比例Table 1 Mixed proportion of dead and live Corynebacterium pseudotuberculosis

2 结果与分析

2.1 菌液灭活时间通过对不同温度灭活处理的伪结核棒状杆菌的活菌计数，发现当温度≥70℃时，所有菌体均被杀灭，灭活效果较好。

表2 灭活效果统计结果Table 2 Statistical results of inactivation effects

2.2 PMA最佳曝光时间通过对最适曝光时间的筛选，发现随着曝光时间的增加，DNA条带亮度逐渐减弱，当曝光时间为15 min时，PMA-PCR扩增产物完全消失，说明最佳曝光时间为15 min，可以完全抑制死菌的PCR扩增，见图1。

图1 PMA最佳曝光时间Fig.1 PMA optimal exposure time

2.3 PMA的最适使用浓度筛选由图2可知，随着PMA浓度增加，PMA与灭活伪结核棒状杆菌DNA结合越多，DNA的亮度也随之减弱。当PMA浓度大于20 μmol/L时，目的基因片段消失，表明热灭活伪结核棒状杆菌的PCR扩增被完全抑制。因此，完全热灭活抑制伪结核棒状杆菌PCR扩增的最小PMA浓度为20 μmol/L。由图3可知，PMA浓度为15～30 μmol/L时，DNA亮度一致，但当PMA浓度达到35 μmol/L时，DNA亮度开始减弱，说明PMA对活菌DNA扩增开始产生一定的抑制作用。因此，不抑制活伪结核棒状杆菌PCR扩增的PMA最大浓度为30 μmol/L。故确定PMA最适浓度为20 μmol/L。

2.4 PMA-PCR的特异性通过对PMA-PCR检测方法的特异性分析，发现所有参考菌株中，仅伪结核棒状杆菌的基因组扩增出了单一目的条带，其他菌株无条带，与预期结果一致，见图4。

图2 完全抑制热灭活伪结核棒状杆菌PCR扩增的最小PMA浓度Fig.2 The minimum PMA concentration for PCR amplification of thermoinactivated pseudomonas tuberculosis

图3 不抑制伪结核棒状杆菌活菌PCR扩增的最大PMA浓度Fig.3 Does not inhibit the maximum PMA concentration of PCR amplification of live bacteria of Corynebacterium pseudotuberculosis

图4 特异性检测Fig.4 Specific detection

2.5 PMA 对不同比例活菌/死菌的样品检测效果在PMA-PCR最适反应条件下，当含有固定数量的死伪结核棒状杆菌时，DNA亮度随活伪结核棒状杆菌数量减少而逐渐减弱，当活菌浓度为1×102cfu/mL时，DNA的亮度消失（见图5）；当含有固定数量的活伪结核棒状杆菌时，DNA亮度一致，不随死菌数量的变化而变化，结果如图6。因此，在含有不同比例的死、活伪结核棒状杆菌的悬液中，20 μmol/L浓度的PMA能够完全抑制死伪结核棒状杆菌的PCR扩增，且不对活菌产生抑制作用，检测活菌最低浓度达到1×104cfu/mL。

图5 固定数量死菌与变化数量活菌混合液PMA-PCR检测结果Fig.5 PMA-PCR results of a fixed number of dead bacteria and varying amounts of live bacteria mixture

图6 固定数量活菌与变化数量死菌混合液PMA-PCR检测结果Fig.6 PMA-PCR results of a fixed amount of live bacteria and varying amounts of dead bacteria mixture

3 讨论

伪结核棒状杆菌是一种典型的接触传播性疾病，具有传播快、发病率高的特点，可引起浅表淋巴结及肝脏、肺脏等多个脏器的炎症反应，出现大小不等的结节，严重时，引发器官的衰竭，造成死亡[8]。该菌感染动物后，会影响动物消化道功能，导致机体出现营养不良、生产性能下降等症状，给养殖业带来巨大危害，近年来已引起学者广泛关注[9]。目前，针对该病的治疗药物及疫苗产品相对较少，对病灶部位消毒处理是该病的主要治疗手段。此外，伪结核棒状杆菌对生长条件要求较高，普通微生物的培养条件难以达到该菌分离纯化的目的[10]。在疫病诊断方面，直接对样品中伪结核棒状杆菌进行分子鉴定时，可能受死菌基因组影响，造成结果误判，无法实现合理用药。而基于PCR的分子生物的检测的方法应用较多，但无法判断病原菌死活状态，难以达到准确检测的目的。因此，对伪结核棒状杆菌活菌的快速、准确的检测对疫病防控十分关键。

PMA是一种具有高度亲和力的光敏DNA染料能选择性地与死菌DNA分子共价交联，阻断DNA分子的PCR扩增。而较高浓度的PMA对活菌的细胞膜会产生渗透作用，因此，PMA的使用浓度需要既能完全抑制死菌的PCR扩增，又不会对活菌的PCR扩增产生抑制作用。本研究结果表明，PMA浓度为20 μmol/L时，能够完全抑制热灭活伪结核棒状杆菌的PCR扩增，当PMA浓度超过30 μmol/L时，对活伪结核棒状杆菌的PCR扩增产生一定的抑制作用，在最适反应条件下，所建立的PMA-PCR检测方法具有较高的特异性，且在死、活伪结核棒状杆菌混合液中对活菌的最低检测限度为1×104cfu/mL。

4 结论

本研究建立的PMA-PCR检测方法可快速、有效地针对山羊伪结核棒状杆菌进行病原细死/活检测，在指导合理用药及病原菌分离培养与鉴定方面具有重要作用，也为该病防控提供了理论依据。