鸡肠炎沙门氏菌的分离鉴定与药敏试验

崔苗苗，佟彦林，李 宁，苏玉铭，魏 澍，任玉峰，李欣南，李 冰，周铁忠⋆

（1.锦州医科大学畜牧兽医学院，辽宁 锦州 121001；2.辽宁省动物卫生监测预警中心，辽宁 沈阳 110001；3.辽宁省动物疫病预防控制中心，辽宁 沈阳 110161；4.辽宁省大连市动物疫病预防控制中心，辽宁 大连 116037；5.辽宁省兽药饲料畜产品质量安全检测中心，辽宁 沈阳 110015）

沙门氏菌是引起人类和动物肠炎的主要致病菌之一，根据O抗原和H抗原的不同，可将其大约分为2 637个血清型[1]，沙门氏菌的各个血清型在自然界中引起人和动物的感染能力有所不同，只有一小部分才会引起感染[2]。鸡沙门氏菌引起鸡的3种类型疾病分别是鸡白痢、禽伤寒和禽副伤寒，可通过种蛋垂直传播，引起受精率和孵化率降低，雏鸡生长迟缓和下痢，成年鸡卵巢炎而产蛋下降，或肝脏破裂出血而死亡，是养禽业最常发的传染病之一，给养禽业带来了巨大的损失。实际生产过程中，由于应用大量抗生素和化学性抗菌药物对本病进行预防控制，造成了严重的细菌耐药性和禽蛋肉产品中的药物残留，导致了本病的防治困难和食品安全问题[3]。为了预防新耐药菌株的产生，更有效地治疗鸡肠炎沙门氏菌病，本试验对辽宁某规模鸡场进行了鸡沙门氏菌鉴定分型和敏感药物筛选，为鸡沙门氏菌病的诊断和防治提供了参考依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 病料的采集 于2017年9月，辽宁省锦州市某规模化养殖场，饲养的6 000只AA肉鸡，有一栋约2 000只12日龄左右肉鸡雏疑似鸡沙门氏菌感染发病，选择具有典型鸡沙门氏菌临床症状的病死鸡100只，无菌取其肝脏、脾脏和肠道，冷藏送到实验室用于分离细菌。

1.1.2 试验动物 选择某鸡白痢净化种鸡场孵化的AA雄性肉雏鸡，5日龄12只；经过鸡白痢抗体检测为阴性，经过支原体、ND、AI、鸡球虫病等其他病原检测也均为阴性，作为分离菌株致病性试验的试验动物。

1.1.3 试验试剂 营养琼脂、SS培养基购于青岛海博生物技术有限公司，Gill green核酸电泳染料、dNTP Mix、DL 2000购于北京百泰克有限公司；细菌基因组DNA提取试剂盒、胶回收试剂盒购于北京索莱宝科技有限公司；API NaCl 0.85%培养基和ID32E鉴定条均购自BIOMERIEUX公司；引物由南京思普金生物科技公司设计。

1.2 试验方法

1.2.1 细菌分离培养和形态观察 无菌条件下，将100份病料划线于SS鉴别培养基，37℃，培养18～24 h，挑取单个菌落，革兰氏染色镜检，观察细菌形态、颜色，反复此过程直至获得纯培养。

1.2.2 生化鉴定 将上述获得的单菌落，在营养琼脂平板上划线36±1℃培养24 h。将待检细菌单个菌落，悬浮于3 mL悬浮培养基，制备0.5麦氏浓度的菌悬液，使用自动加样器将菌悬液滴入试纸条反应杯中，每个反应杯中滴入55 μL，菌液和试剂滴加完毕后，37℃培养24 h，用细菌鉴定仪判读。结果参考临床微生物学诊断与图谱[4]

1.2.3 基因鉴定分型

1.2.3.1 特异性引物的设计 鉴定鸡肠炎沙门氏菌的特异性引物设计参照SH Park等[5]根据SefA gene，设计S.Enteritidis引物序列为：

STEF：5’-AACAACGGCTCCGGTAATGAGATTG-3’

STER：5’-ATGACAAACTCTTGATTCTGAAGATCG-3’

1.2.3.2 基因组DNA 将分离纯化后的细菌，挑取单个菌落接种于的TSB液体培养基中，37℃，220 r/min震荡4～5 h，肉眼观察待菌液浑浊时，无菌挑取菌液进行涂片、染色、镜检，证实为纯培养物，然后将纯菌液按照《细菌基因组DNA提取试剂盒》（Solarbio）说明和步骤方法，提取细菌的基因组。

1.2.3.3 PCR扩增 以提取的基因组DNA为模板与合成的特异性引物进行PCR扩增。PCR反应体系为30 μL：菌液 DNA 模板 3 μL、2×Tap Master Mix 15 μL、上、下游引物各 1 μL、ddH2O 10 μL。PCR反应条件：94℃预变性2 min；94℃变性30 s，60℃退火20 s，72℃延伸20 s，共30个循环；72℃最后延伸10 min。

将PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳，目的条带进行胶回收并送至生物公司测序，测序结果在Genbank中进行序列比对。

1.2.4 致病性试验 选取5日龄雄性肉鸡12只，随机平均分为2组，对照组灌胃灭菌PBS溶液1 mL/只和试验组灌胃3.2×108CFU/mL重悬菌液1 mL/只，灌胃后隔离饲喂，以防交叉感染，每隔4 h观察1次，连续观察72 h，并记录试验动物的发病以及死亡情况。将死亡的试验鸡剖检，无菌采取肝脏、脾脏等病料，接种SS培养基，培养18～24 h后，使用革兰氏染色，油镜下观察，从发病和死亡的试验鸡体内分离回收细菌。

1.2.5 药敏试验 将分离已鉴定的菌株进行14种抗菌药物的药敏检验，用冻干型细菌定量药敏检测盒进行抗菌药物的敏感性检测，参照美国临床实验室标准化协会（Clinical and Laboratory Standards Institute，CLSI）（2012）判定标准[6]，并对所检测样品进行结果判定和分析[7-8]。

2 结果与分析

2.1 细菌分离培养结果100份病料接种的SS培养基，有73个SS培养基上可看到呈露珠样的细小、无色透明或中心略带黑色光泽、圆整、湿润并光滑，菌落的直径大约有2～3 mm。使用革兰氏染色法染色后镜检结果为：革兰氏阴性、短杆菌、粉红色、两端稍圆，符合沙门氏菌的菌落及镜检特征。

图1 鸡沙门氏菌的生长状态与形态结构Fig.1 Growth state and morphological structure of Salmonella

2.2 细菌生化试验结果经生化试验得到结果见表1。将此生化结果通过与临床微生物学诊断与图谱[4]比对发现符合沙门氏菌生化特征。

2.3 PCR鉴定结果PCR产物扩增电泳后，在约310 bp处出现目的片段，与肠炎沙门氏菌基因大小一致；阴性对照无条带出现。

图2PCR结果Fig.2 PCR results

表1 分离菌的生化结果Table 1 Biochemical results of isolates

2.4 致病性试验结果接种分离菌的试验鸡于感染后12 h，羽毛污秽、精神沉郁、食欲下降、喜卧不愿意走动；感染后24 h，试验鸡拉白色或淡黄色稀粪，严重者肛门被粪便糊死；感染后36 h，试验鸡全部死亡，死亡率达到100%。死亡后，剖检可见肝脏土黄色，有淤血斑点，脾脏肿大。在SS培养基上形成露珠样无色透明、较小的菌落；镜下观察为阴性小杆菌，两端稍圆，粉红色；符合沙门氏菌生长情况和形态要求。通过以上各项检测结果，证明所分离的细菌为鸡源沙门氏菌。

2.5 药敏试验结果将分离已获得的73株细菌进行14种抗菌药物的药敏检验，结果显示，该分离菌对氨苄西林、磺胺异噁唑等耐药性较强，而对头孢噻呋、恩诺沙星等药物的耐药性较弱，具体如表2所示。

表2 肠炎沙门氏菌的药敏试验结果Table 2 Results of drug susceptibility test of S.Enteritidis

3 讨论

3.1 关于沙门氏菌血清分型据报道鸡源沙门氏菌血清型有肠炎、鼠伤寒、婴儿、印第安纳、鸡白痢、肯塔基、德尔卑、汤卜逊、鸭、火鸡、明斯特、胥伐成格隆等，虽然血清型种类繁多、菌株复杂，分布具有很强的区域特点，但以肠炎沙门氏菌、鼠伤寒沙门氏菌、印第安纳沙门氏菌和德尔卑沙门氏菌等为主，优势血清型为肠炎、婴儿、鼠伤寒、印第安纳和鸡白痢。辽宁省常发肠炎沙门氏菌、杜伊斯堡沙门氏菌、鹅沙门氏菌，本次鉴定肠炎沙门氏菌血清型在我国北京、上海、河北、山东地区均有报道[9-11]，沙门氏菌的血清型分布也具有明显的地域性特点，肠炎沙门氏菌在北美地区的美国、加拿大，在欧洲的丹麦、荷兰也有报道[12]。沙门氏菌血清型鉴定方法有传统玻片凝集法、Luminex-xMAP法、免疫分析检测技术、环介导等温扩增、基因芯片技术（gene chip）、沙门氏菌的新型检测技术（如生物传感器检测技术、纳米技术等）。传统的血清学鉴定方法操作简便，但血清价格昂贵，鉴定过程步骤多，耗费时间长，要求试验人员有丰富的经验，即便如此，操作人员的主观判断仍有可能造成误差。鉴于沙门氏菌血清型在流行病学研究中的重要性和传统血清型鉴定方法的不足，研究人员开展了多种方法的研究以弥补传统血清鉴定方法的不足。本研究是应用的是基于沙门氏菌fli C特异性基因建立的PCR法对沙门氏菌血清型进行鉴定分型，与其他研究者建立的方法相比，不仅具有反应快速、高效、灵敏和成本低的优点，且理论上可以鉴定589种沙门氏菌血清型；只要有普通PCR仪的实验室就可以开展沙门氏菌血清型的分型鉴定，能满足一般实验室的要求。

3.2 关于沙门氏菌的致病机制和致病性研究表明沙门氏菌的致病机制取决于其本身的毒力和宿主的结构，菌株的毒力由毒力因子决定，很多沙门氏菌的毒力因子最近才确定，如毒力岛的毒力因子，由于毒力质粒、毒素、菌毛、鞭毛早已发现及研究了几十年，所以被称为传统（典型）毒力因子。到目前为止只发现8种血清型含有毒力质粒。沙门氏菌既能产生内毒素也能产生外毒素，内毒素是沙门氏菌细胞壁的脂多糖成分，可以导致体内和体外多样化反应。外毒素分为2种类型，包括细胞毒素（神经毒素）和肠毒素，目前关于沙门氏菌外毒素的作用方式了解非常有限。沙门氏菌入侵的最佳起始部位是滤泡上皮细胞，其次是在肠道上的派伊尔氏结上细胞，其位于肠道黏膜表面，所以其主要侵袭部位在肠道。关于沙门氏菌的致病性研究一直选择健康SPF级小白鼠作为试验动物[13-14]，而本次试验首次选择雏鸡做为靶动物进行沙门氏菌的致病性研究，更能科学直接地验证其致病性。张珍（2017）[15]研究表明鸡源沙门氏菌对小鼠有较强的致病性，致死率达到60%～80%；本试验选择某鸡白痢净化种鸡场孵化的，经过鸡白痢抗体检测为阴性，经过支原体、ND、AI、鸡球虫病等其他病原检测也均为阴性的雄性雏鸡，作为分离菌株致病性试验动物，攻菌后36 h致死率达到100%，证明鸡肠炎沙门氏菌辽宁流行菌株具有很强的致病性。

3.3 关于沙门氏菌的耐药性现状在辽宁锦州地区分离得到的肠炎沙门氏菌的药敏结果与其他文献报道的结果稍有不同，可能是由于血清型不同、细菌本身突变以及地区用药的习性有关。刘新静[16]2012～2014年在对从河北省几个地区的养殖场分离出的142株鸡沙门氏菌对15种药物产生各种程度的耐药，对磺胺异噁唑耐药率为81.69%，四环素则为40.41%。王德宁[17]将来自哈尔滨疑似沙门氏菌感染的鸡场分离到的44株菌株，进行了耐药的分析试验，结果显示，氨苄西林对沙门氏菌具有最高的耐药率，达到95.5%。韦婷[18]于2012～2013年期间检测了四川地区市场鸡肉中沙门氏菌的含量，结果其平均检出率为28.0%；并对其做了耐药性分析，数据显示对3种以上抗生素耐药的菌株达72.13%，最耐药的抗生素为萘啶酸。关茹飞等[19]对乌鲁木齐周边鸡场的沙门氏菌进行耐药性检测，检测到的80株鸡源沙门氏菌对环丙沙星和恩诺沙星的耐药最为严峻。周荣云等[20]在扬州地区采集病料分离得到的21株鼠伤寒沙门氏菌，药敏试验结果表明对链霉素耐药占42.86%，对复方新诺明占47.62%，10株分离株出现了多重耐药现象。建议临床上合理选择并应用抗微生物类药物，采取联合用药或者轮换用药；降低细菌耐药性的产生与发展，迫切需要开发抗感染中药提取物以避免耐药性产生和提高疗效。沙门氏菌产生耐药性是因为细菌本身能改变抗微生物药的作用靶位，阻碍了抗微生物药被识别[21]，动物机体对抗微生物药的转化利用率降低，治疗效果不显著，有些抗微生物药甚至以原液直接通过粪便、尿液、唾液等方式排出体外，进而破坏了生态系统的平衡[22-25]，世界卫生组织将沙门氏菌列入严重危害的食品传播性病原体，迫在眉睫解决这个问题成为重中之重[26]。