重度阿尔茨海默病血清差异表达microRNA靶基因功能初步分析☆

罗新妮 宁玉萍 施海珊 侯乐 方子妍

阿尔茨海默病（Alzheimer disease，AD）是进展性神经退行性痴呆疾病，给社会和患者家庭带来沉重负担[1]。微小 RNA（microRNA,miRNA）是一类长度为19～23个核苷酸的高度保守非编码RNA，在转录后水平调控基因表达，对神经元形成、分化、突触塑造等过程具有重要调节作用。研究miRNA表达谱变化规律可了解AD发病过程[2]。有研究表明差异表达的miRNAs对AD患者具有良好的诊断敏感度和特异度[3]，且部分miRNAs在AD患者的血清和脑脊液均与对照组存在表达差异[4]。但目前研究鲜有针对重度AD患者miRNA表达谱的研究。本研究使用高通量测序技术全面分析重度AD的血清miRNA表达谱特征，挖掘在重度AD患者血清中差异表达的miRNA，通过gene ontology（GO）功能富集分析和Kyoto encyclopedia of gene and genomes（KEGG）通路富集分析初步探索这些miRNA参与的生物学功能和通路，为深入探讨miRNA与AD发病机制的关联及寻找AD生物标志物提供依据。

1 对象与方法

1.1 研究对象重度AD组为2016年3月至6月广州市惠爱医院住院AD患者。入组标准：①符合《美国精神障碍诊断与统计手册第四版》（DSM-Ⅳ）痴呆诊断标准，及美国国立神经病语言障碍卒中研究所和AD及相关疾病协会（NINCDS-ADRDA）中“很可能的阿尔茨海默病”诊断标准[5]，由2名神经内科副高或以上职称医师进行评估和诊断；②简易精神状态检查表（mini-mental state ex amination,MMSE）评分低于界值，即文盲≤17分、小学≤20分、初中及以上≤24分；③蒙特利尔量表 （Montreal cognitive assessment,MoCA）≤26分；④临床痴呆评定量表 （clinical dementia rating,CDR）为3分。排除标准：①其他脑部器质性改变所致痴呆，如脑出血、脑梗死、占位性病变等；②代谢性疾病、物质滥用及感染所致痴呆；③混合性痴呆；④患有其他重大躯体疾病或精神障碍。共收集7例重度AD患者。

对照组为2016年3月至6月在广州市惠爱医院公开招募的无认知障碍表现老年人。入组标准：①年龄≥60岁；②无认知障碍主诉和症状，由2名神经内科副高或以上职称医师进行评估；③神经系统体查正常；④MMSE评分高于界值，即文盲＞17分，小学＞20分，初中及以上＞24分；⑤CDR为0分；⑥无神经或精神疾病史。排除标准：①患有脑器质性病变；②患有其他重大躯体疾病。共收集5名对照。

本研究经过广州市惠爱医院伦理委员会批准。所有研究对象或其法定监护人均自愿签署知情同意书。

1.2 研究方法

1.2.1血清采集和处理 所有被试者于清晨空腹肘静脉穿刺采血5mL，用EDTA抗凝管收集。样品在4℃下3000rpm离心15min，聚乙烯管分装血清，置-80℃冻存待测，避免反复冻融。

1.2.2总RNA提取及纯度、浓度检测 Trizol法提取单个血清样本的总RNA，采用超微量紫外分光光度计（Nanodrop2000，美国）和芯片生物分析仪（Agilent2100，美国）测定RNA的纯度和浓度。本研究样品RNA溶液的OD260/OD280比值均在1.8～2.0，RNA含量在20ng以上，纯度和浓度均符合测序要求。

1.2.3构建文库、测序和数据质控分析 RNA溶液经聚丙烯酰胺凝胶电泳 （polyacrylamide gel electrophoresis，PAGE）， 将分子量在18～30nt的 RNA分子切胶富集，然后连接3’和5’接头，对连接了两侧接头的小RNA样本进行反转录PCR，生成cDNA文库，并用高通量测序仪（Illumina HiSeqTM2500，Illumina，美国）进行测序。测序得到的原始数据经过去污染、去低质量、去接头的过程获得干净tag序列。对tag序列进行长度分布统计，数量及丰度、基因组比对等分析；与miRBase数据库比对鉴定样品中miRNA，得到miRNA表达谱（基迪奥生物，广州）。

1.2.4差异表达miRNA分析 采用edgeR软件对AD和对照组间miRNA的count值进行差异分析，并使用负二项分布检验计算组间比较P值，利用miRNA的表达量值 （transcripts per million，TPM）进行差异倍数计算。差异表达miRNA（differentially expressed miRNA，DEmiRNA）是指在AD和NC两组的表达差异倍数 （fold change，FC）绝对值≥2且P＜0.05的 miRNA[6]。

1.2.5靶基因预测、GO及KEGG分析 使用RNAhybrid（v2.1.2）+svm_light （v6.01）、Miranda （v3.3a）及TargetScan（v7.0）3个软件对DEmiRNA的靶基因进行预测，以3个分析结果的交集作为靶基因预测结果。对靶基因进行GO功能和KEGG生物通路注释，统计靶基因映射到的GO功能和KEGG生物通路的基因数目，应用超几何检验计算P值，找出与整个基因组背景相比靶基因显著富集的GO term和 Pathway，以P＜0.05为检验水准，满足此条件的GO term或Pathway定义为靶基因显著富集的GO term或Pathway。

1.3 统计学方法数据采用SPSS20.0进行统计分析。重度AD组和对照组的年龄、受教育年限、认知测试分值等正态分布资料比较采用独立样本t检验，性别比较采用Fisher精确检验，miRNA在两组间表达差异采用负二项分布检验。检验水准α=0.05，双侧检验。

2 结果

2.1 人口学与临床资料7例患者中男2例、女5例，年龄55～92岁，平均（72.2±12.3）岁，病程2～10年，平均（5.86±3.02）年，MMSE 评分2～14分，平均为（2.7±5.0）分，MoCA 评分0～5分，平均（0.7±1.9）分。5名对照中男3名、女2名，年龄62～70岁，平均（65.6±3.6）岁，MMSE 评分28～30分，平均（28.8±0.8）分，MoCA 评分26～28分，平均（26.6±1.1）分。两组性别（P=0.558）、年龄（t=1.140，P=0.281）及受教育年限（t=-1.544，P=0.122）差异无统计学意义。重度 AD 组 MMSE （t=-11.303，P＜0.001） 和 MoCA（t=-27.091，P＜0.001）评分低于对照组。

2.2 miRNA测序结果与对照组相比，重度AD组中共有112个 DEmiRNA（|FC|≥2且P＜0.05），其中上调57个，下调55个。上调且测序reads数≥10的主要 DEmiRNA 包括 mir-206-y（FC=5.8，P＜0.01）、hsa-miR-199a-3p（FC=4.9，P=0.02）、hsamiR-199b-3p（FC=4.9，P=0.02）、mir-1-y（FC=4.6，P=0.02）、hsa-miR-1307-3p（FC=4.6，P=0.03）、hsa-miR-1-3p（FC=4.4，P=0.03）及 hsa-miR-4446-3p（FC=3.9，P=0.04），下调且测序 reads数≥10的 DEmiRNAs为 hsa-miR-215-5p（FC=-3.4，P＜0.01）。 见表1。

表1 主要DEmiRNA的名称、序列及表达差异倍数

2.3 GO功能富集分析和KEGG通路富集分析GO功能富集分析结果表明DEmiRNA的靶基因参与蛋白结合、离子结合、转运金属结合等分子功能的调节（表2），细胞内器官、细胞器官、细胞膜组成器官及细胞膜等调节（表3），以及生物代谢过程和生物调节等生物学过程（表4）。KEGG通路富集分析结果显示有6.42%的靶基因参与PI3KAkt信号通路，MAPK信号通路、Ras信号通路、Rap1信号通路、粘连复合体等也是DEmiRNA靶基因主要参与的通路（表5）。图1是靶基因参与PI3K-Akt信号通路的KEGG通路分析图，其中红色方框为DEmiRNA的靶基因。

表2 GO富集的分子功能分析

图1 靶基因参与PI3K-Akt信号通路的KEGG通路分析图。原图来自KEGG数据库（www.genone.jp/kegg/），其中红色方框为重度AD患者DEmiRNA的靶基因

表3 GO富集的细胞组成分析

3 讨论

表4 GO富集的生物学过程分析

本研究使用高通量测序技术对重度AD患者的血清miRNA进行研究，结果提示重度AD组和对照组的血清miRNA表达谱存在部分差异。与AD及轻度认知障碍（mild cognitive impairment,MCI）患者血清miRNA的研究结果一致[3-4,7]。此外，本研究证实mir-206-y及hsa-miR-215-5p是DEmiRNA，在重度AD患者血清中前者表达上调，后者表达下调。miR-206-y和hsa-miR-215-5p与AD的发生发展有密切关系：在AD转基因小鼠模型中，miR-206表达上调导致脑源性神经营养因子的表达减少[8]；而miR-215表达下降能够重新激活细胞周期，导致神经元凋亡，从而引起神经退行性改变[9]；且遗忘型MCI患者血清miR-206表达水平明显高于正常对照组[7]，可作为预测遗忘型MCI患者痴呆转化率的生物标志物[10]。本研究进一步证实mir-206-y和hsa-miR-215-5p是AD疾病潜在的生物标志物。

表5 靶基因主要富集的10个KEGG通路

本研究中GO功能富集分析显示DEmiRNA的靶基因参与蛋白结合、离子结合、转运金属结合、细胞器与细胞膜等生物代谢和调节过程。以上生物代谢和调节过程被证实与AD的发生发展密切相关：研究显示AD患者大脑的老年斑中富含金属离子[11]；AD患者脑内葡萄糖代谢降低远早于β淀粉样蛋白沉淀发生，而酮体是脑内替代葡萄糖的主要能量来源，脑中能量代谢底物转换为酮体是AD早期代谢特征[12]。本研究提示血清DEmiRNA与AD的病理变化存在一致性，但其关联性仍需进一步探索。

在KEGG通路分析中，本研究发现DEmiRNA的靶基因主要参与PI3K-Akt信号通路调控。既往研究显示，PI3K-Akt信号通路与AD患者海马神经元的生存、凋亡和细胞代谢密切相关[13-14]。β淀粉样（Aβ）蛋白低聚体阻断PI3K-Akt信号通路时可导致大脑神经元易损伤性增加[15]，提示PI3K/Akt信号通路参与AD的病理改变过程。本研究提示重度AD患者血清DEmiRNA或可反映AD患者大脑PI3K-Akt信号通路调控的异常情况。

综上所述，本研究表明重度AD患者血清存在显著的miRNA表达差异，其中mir-206-y和hsa-miR-215-5p是AD疾病潜在的生物标志物。且GO功能和KEGG通路富集分析提示血清DEmiRNA作用的靶基因与AD病理改变密切相关。考虑到重度AD患者的特征性病理变化更明显，血清microRNA谱系的改变可能较轻中度AD更为典型，本研究仅纳入重度AD患者，而未纳入不同病程阶段的认知功能障碍患者，并且本研究样本量较小，仅初步探索miRNA差异表达，靶基因分析亦有待深入，这些不足需在未来研究中加以改进。