脑脊液相关标志物检测在阿尔茨海默病痴呆诊断中的应用

孙云闯 金海强 孙永安 白静 黄一宁

阿尔茨海默病（Alzheimer disease,AD）是最常见的神经变性病痴呆，其早期（无症状期或轻度认知障碍期）的诊断困难，PET淀粉样蛋白显像和脑脊液标志物检测 （Aβ42、T-tau和P-tau181）是最主要的方法[1]。脑脊液标志物检测方法简单易行，更容易进行广泛推广。国际上很多国家已开展了AD相关脑脊液标志物的检测，但各实验室间及实验室内部批次间检测的变异性较高[2-3]，因此建议各实验室建立自己的正常范围及界定值[4]。我国尚未开展AD相关脑脊液标志物的常规检测。为此，借鉴相关指南的推荐[5-6],我们对脑脊液标本采集、储存、检测程序等步骤进行了更新，目的是探索AD 相关脑脊液标志物（Aβ42、 T-tau、 P-tau181、Aβ42/T-tau和 Aβ42/P-tau181）检测方法的可靠性，验证其在我国应用的可行性，界定我中心各检测标志物的界定值（cutoff值），为进一步广泛开展该项检测提供经验。

1 对象与方法

1.1 研究对象

1.1.1AD痴呆组2015年7月至2017年2月因记忆力下降就诊于北京大学第一医院神经内科的AD痴呆患者，所有患者均符合2011年NIA-AA指南典型AD型痴呆的核心临床诊断标准[7]，且包括：①年龄50～80岁；②病程1年以上；③均完成头MRI平扫；④神经心理量表测验包括简易精神状态检查（mini-mental state examination，MMSE），MMSE＜26，蒙特利尔认知评估量表（montreal cognitive assessment,MoCA）检查；⑤部分患者按统一方案完成匹兹堡复合物PET（Pib-PET）检查[8]；所有AD型痴呆均经有经验的专业医生综合患者的资料等进行诊断。

排除标准：以非记忆力下降为主要表现的患者或不典型AD患者；临床、影像等辅助检查提示其他类型的痴呆如血管性痴呆、额颞叶痴呆、路易体痴呆以及头MRI发现颅内占位、正常颅压脑积水、明显脑白质病变、明显脑血管病影像等改变的患者。

1.1.2认知正常组 选取2015年7月至2017年2月间于北京大学第一医院神经内科住院行腰穿的年龄80岁以下患者，主要包括周围神经病、脊髓病、腰骶神经根病、神经痛等无头部症状的患者，以及头痛、脑膜炎、癫痫、锥体外系疾病、特发性高颅压等有颅脑症状但头MRI无明确脑实质受累的患者，所有患者均否认有记忆等认知功能下降并经家属证实；所有AD痴呆组及认知正常组均经本人或家属签字同意行腰穿检查；

1.2 检测方法受试者脑脊液留取及储存方法均按2012年VANDERSTICHELE等[5]推荐的方法，具体如下：所有受试者均由有经验的腰穿操作者进行腰穿检查，穿刺间隙首选L4/5间隙，穿刺不成功者在L3/4间隙进行，确认脑脊液外观清亮后将其留取至PP管，并分别行脑脊液常规、生化、涂片等检查，留取最后一管2mL拟作为AD标志物检测。腰穿结束后3h内将其转移至1.5mL PP管内，并放至-80°冰箱内冷冻保存至检测之日。

脑脊液Aβ42、T-tau和 P-tau181均采用 Innotest试剂盒，用ELISA方法进行，检测由有一名经验丰富的操作者在不知受试者诊断情况下独立进行，脑脊液标本均采用双副孔检测，按标准检测步骤分别进行加样、洗板、过夜，最后经酶标仪分光度测定。将测定数据转换后采用非线性四参数曲线方法对脑脊液 Aβ42、T-tau和 P-tau181进行取值，Aβ42/T-tau、Aβ42/P-tau181经上述取值后计算得出。

1.3 统计学方法采用SPSS19.0进行统计分析。正态分布的计量资料采用±s表示，非正态分布的计量资料采用中位数（四分位数间距）表示；计数资料采用频数（百分比）表示；正态分布的两组统计学比较采用独立样本t检验，非正态分布的两组统计学比较采用非参数检验；采用ROC曲线计算 youden 指数进行 CSF Aβ42、T-tau、P-tau181、Aβ42/T-tau和Aβ42/P-tau181诊断两组人群的界定（cutoff）值，并以此计算各指标敏感性和特异性；检验水准α=0.05。

2 结果

2.1 一般情况本研究共入组符合入组标准的AD痴呆17例，其中轻度痴呆8例，中度痴呆7例，重度痴呆2例，12例患者完成MMSE评分，中位MMSE评分15分，8例患者完成MoCA评分；5例患者完成匹兹堡复合物PET检查；认知正常组49例。两组人口学资料及各检测指标统计学比较见表1：两组性别差异无统计学意义，在年龄及脑脊液各检测指标差异均有统计学意义；正常组年龄较AD痴呆组小；正常组 Aβ42、Aβ42/T-tau、Aβ42/P-tau181值较 AD痴呆组低，T-tau和P-tau181值较AD痴呆组高

表1 正常组和AD痴呆组人口学资料及各检测指标

2.2 对各检测指标绘制ROC曲线见图1，ROC曲线相关数值见表2，结合ROC曲线计算youden指数得出各检测指标的cutoff值，并计算其敏感性及特异性见表3。结果显示，所有ROC曲线指标在鉴别AD型痴呆组及认知正常组间差异均有统计学意义（P<0.001），Aβ42/T-tau曲线下面积最大，其次为 Aβ42/P-tau181；Aβ42/P-tau181对鉴别 AD型痴呆与正常对照的敏感性和特异性最好，其次是 Aβ42/T-tau；Aβ42和 P-tau181对鉴别两组的特异性较好，但敏感性较差，而T-tau鉴别两组的敏感性较好，但特异性较差。以上结果提示，本研究中所有检测指标应用均有一定的意义。

表2 各指标ROC曲线相关参数及统计学检验

3 讨论

表3 各检测指标cutoff值及其诊断AD痴呆的敏感性（sen）和特异性（spe）

图1 各检测指标ROC曲线

随着对AD研究的不断深入，AD相关脑脊液标志物在AD早期诊断中的作用越来越重要。近年来更新的国际AD诊断指南中，脑脊液标志物的地位不断提高[1,7]。但由于实验条件的不同以及标志物本身问题，各实验室检间及实验室内部批次间检测的变异性均较高[2-3]，因此目前尚无统一的各标志物的正常取值范围，国际上建议各实验室建立自己的正常值范围及界定值[4]。我国目前在检测方法上尚无广泛研究，结合本实验室既往检测脑脊液Aβ42水平的经验及国际相关指南的推荐，我们对检测方法进行了更新，通过对AD痴呆人群及认知正常人群脑脊液AD相关标志物检测结果，本研究显示：AD痴呆组各脑脊液标志物与认知正常组差异具有统计学意义，正常组 Aβ42、Aβ42/T-tau和 Aβ42/P-tau181值较 AD 组低，T-tau和P-tau181值较AD痴呆组高；各指标均能鉴别正常认知组及AD痴呆组；该结果符合AD病理生理机制中相应标志物的变化趋势[9]。本研究得到了各指标诊断AD痴呆人群的cutoff值，各指标界定值均接近国外研究报道的cutoff值[9]。这些结果表明，AD相关脑脊液标志物检测方法在我国是可行的，我国人群各指标接近国外人群检测值，该方法可进行广泛开展及推广。

本研究中各检测指标诊断AD型痴呆与正常人群比较的敏感性和特异性显示：各指标特异性较敏感性更好，目前国际上推荐PET淀粉样蛋白分子显像和脑脊液标志物主要用于不典型AD患者的诊断以及轻度认知障碍患者是否由AD所致[10]，因此脑脊液标志物较高的特异性有助于排除AD的诊断进而寻求其他导致患者认知损害的原因。就单个指标而言，Aβ42/P-tau181的敏感性和特异性最好，该结果与国外文献报道基本一致[11-12]，目前认为，Aβ42/P-tau181或Aβ42/T-tau的敏感性和特异性均较高，且不同试验间数值稳定，越来越被认为是诊断AD脑脊液标志物中更为可靠的指标，尤其是Aβ42/P-tau181水平更为稳定。我们在研究中也有类似体会，认知正常组不同试验间Aβ42、T-tau、P-tau181均有较大波动，尤其是 Aβ42最为明显，但 Aβ42/P-tau181或 Aβ42/T-tau 相对较稳定，提示 Aβ42/P-tau181或 Aβ42/T-tau比值在 AD诊断中的作用可能更大。

在AD病理生理过程中，Aβ42通常在临床症状出现前多年最先开始沉积形成老年斑，之后是P-tau的沉积形成神经元缠结，脑脊液标志物和PET淀粉样蛋白分子显像均能起到早期诊断作用，两者作用类似，但哪种方法更为准确以及两种检查手段结果不一致情况该如何解释目前尚无定论[13-14]。本研究中亦有PET和脑脊液标志物“不一致”情况出现：AD痴呆组共有5例完成淀粉样蛋白分子显像，其中4例显像阳性，1例为显像阴性。4例阳性患者中有3例呈现出典型AD患者的脑脊液标志物变化，即Aβ42水平降低而T-tau、P-tau181水平升高，1例患者 Aβ42及 Aβ42/P-tau181水平降低而T-tau、P-tau181水平正常；1例匹兹堡显像阴性的患者其 Aβ42、T-tau、P-tau181水平均在正常范围。国外文献关于两者结果不一致情况的原因认为[15-17]：一方面，匹兹堡显像与尸检一致率较高，但亦有匹兹堡显像阴性而尸检符合典型AD表现者，原因可能包括：匹兹堡示踪剂仅能与弥漫性淀粉样斑块结合而不能与可溶性或致密性斑块结合，而后两者亦为AD病理中较为常见的表现；脑脊液Aβ42水平降低通常早于老年斑形成，脑脊液标志物异常而PET显像阴性者可能处于疾病早期，但无法解释患者已处于明显痴呆阶段的情况；另一方面，从检测方法的可靠性上看，脑脊液标志物的检测方法存在一定程度的不稳定，进而可能出现脑脊液标志物阴性而PET阳性的情况[18]。但两者不匹配的原因仍缺乏大规模研究，需更多研究尤其是尸检患者的情况进一步明确。

本研究存在一些不足，首先研究人群的样本量偏少，尤其是AD痴呆组；其次，正常认知组中缺少完全正常的健康对照，部分患者有中枢神经系统症状。且对照组年龄较AD痴呆组轻，有文献报道年龄对Aβ42水平无影响，对Tau水平有一定影响，因此研究结果的扩展受一定影响[19]。但考虑到在我国老年期痴呆及健康人群中进行腰穿检查有一定难度，因此本研究结果仍有一定意义，未来仍需进一步扩大样本量并进行年龄分组研究；第三，AD痴呆组中部分患者为中重度痴呆，早期痴呆病例数少，但研究表明Aβ42及P-tau蛋白的沉积在痴呆不同程度中无明显差异，因此，AD痴呆组人群结论仍有意义。未来研究工作中，仍需要在不同痴呆程度及轻度认知障碍人群中进行更深一步的研究。