铁死亡相关蛋白在AD小鼠海马中的表达☆

李燕新 吕占云 李维 郝延磊

铁死亡(ferroptosis)是一种铁离子依赖的、以脂质过氧化产物和致死活性氧的积累为特点的非典型的细胞死亡方式[1]。长链酯酰辅酶A合成酶4（long-chain fattyacyl-CoA synthetase4,ACSL4）、谷胱甘肽过氧化物酶4（glutathione peroxidase4,GPX4）和胱氨酸-谷氨酸反向转运蛋白系统（the cystine/glutamate antiporter system Xc,XCˉ系统)是其最重要的调控分子[2]。另外，磷脂酰乙醇胺结合蛋白1（phosphatidylethanolamine-binding protein1,PEBP1）也在铁死亡过程中发挥着重要的作用[3-4]。尽管全世界对阿尔茨海默病（Alzheimer disease,AD）的研究投入了大量的人力和财力，但AD的发病机制仍然不明确。有研究显示AD患者脑组织中存在铁的沉积和铁代谢的异常，提示铁的代谢异常可能在AD的发病机制中发挥重要作用[5]。目前铁死亡的机制研究多集中于氧化损伤及铁代谢两方面，且谷氨酸系统受损、铁代谢障碍和脂质过氧化水平升高参与AD的发病，然而铁死亡与AD相关性的研究相对比较少，铁死亡相关蛋白在AD发生发展中的作用尚不清楚。基于先前报道的PSEN1p.G378E突变的AD家系[6-8]，本研究构建了PSEN1p.G378E敲入的AD小鼠，采用免疫印迹的方法检测其海马组织中铁死亡相关蛋白的表达水平，以探讨铁死亡在AD中的作用。

1 动物与方法

1.1 实验动物与分组我们委托赛业生物科技公司进行了PSEN1p.G378E敲入的AD小鼠模型的构建，于济宁医学院SPF级实验动物中心繁殖，根据基因测序结果将其分为WT组、PSEN1p.G378E-/+组和PSEN1p.G378E-/-组，随机选取5月龄的三组小鼠各10只进行实验。

1.2 小鼠基因型的鉴定小鼠出生2周后，剪取2～5mm的小鼠尾尖组织，按照血液/细胞/组织基因组DNA提取试剂盒（TIANGEN公司）的步骤提取DNA后进行PCR反应。PCR引物采用Primer5软件设计，并通过 Primer-BLAST（http//www.ncbi.nlm.nib.gov/tools/primerblast）对照NCBI数据库进行引物特异性匹配，选择合适的引物序列，由上海生工生物工程有限公司合成，F：5’-CTGTACACACCACTTACTGACTTCTC-3’R：5’-CCCAAAAG GTTGTTCTCTGAGAG-3’， 采用30μL 的反应体系： 包括 Taq Hot Start酶0.15μL、Buffer3μL、dNTP3μL、上下游引物（10μM）各1μL、DNA2μL及双蒸水19.85μL。 PCR反应条件：95℃预变性3min，95℃变性30s，60℃退火30s，72℃延伸1min，共35个循环，然后72℃延伸5min，4℃停止。PCR扩增产物经1%琼脂糖凝胶电泳，检测出目的条带后，送上海生物工程公司测序。

1.3 Western blot检测铁死亡相关蛋白的表达10%水合氯醛腹腔注射麻醉小鼠 （0.1mL/10g）后，取小鼠新鲜海马组织，运用液氮研磨的方法提取蛋白，测定蛋白浓度（BCA法），以RIPA裂解液调整蛋白样本终浓度为3mg/mL。配制5%浓缩胶，10%分离胶，每孔蛋白上样量为30μg。电泳约1.5h，转膜90min，用5%的脱脂奶粉室温封闭1h后， 用兔抗 GPX4多克隆抗体（Abclonal，1：2000）、兔抗 SLC7A11多克隆抗体 （Abclonal，1：2000）、兔抗 ACSL4多克隆抗体 （Abclonal，1：2000）、 兔抗PEBP1多 克 隆 抗 体 （Abclonal，1：2000）、 鼠 抗GAPDH 单克隆抗体 （Abcam，1：50000）4℃孵育过夜，二抗辣根过氧化物酶标记山羊抗兔IgG（碧云天，1：1000）室温孵育1h，用化学发光试剂盒（Millipore）进行显色曝光，分析各电泳带灰度值，以GAPDH为内参。

1.4 统计学分析采用SPSS16.0统计软件进行分析，计量资料以（±s）表示，多个样本均数比较先进行方差齐性检验，方差齐则采用单因素方差分析，有统计学差异后再进行两两比较（LSD检验），方差不齐则采用Krudkal-Wallis H检验。检验水准 α=0.05。

2 结果

2.1 小鼠基因型的鉴定根据测序峰图，将小鼠分为三种类型：野生型（wild type,WT）、杂合型（PSEN1p.G378E-/+）、纯合型（PSEN1p.G378E-/-），详见图1。

2.2 铁死亡相关蛋白的表达情况

2.2.1GPX4蛋白的表达情况 WT组、PSEN1p.G378E-/+组和 PSEN1p.G378E-/-组的GPX4蛋白表达具有统计学意义 （F=65.167，P＜0.001），PSEN1p.G378E-/+组的GPX4蛋白表达量是WT组的1.54倍 （P=0.01），PSEN1p.G378E-/-组的 GPX4的蛋白表达量是 WT组的1.97倍 （P＜0.001），PSEN1p.G378E-/-组比 PSEN1p.G378E-/+组增加了27.5%（P=0.002）（表1，图2）。

2.2.2SLC7A11蛋白的表达情况 WT组、PSEN1p.G378E-/+组和 PSEN1p.G378E-/-组的SLC7A11蛋白表达具有统计学意义 （F=22.390，P=0.002），PSEN1p.G378E-/+组与WT组的SLC7A11蛋白表达量无统计学差异（P=0.232），PSEN1p.G378E-/-组的SLC7A11的蛋白表达量是WT组的1.32倍（P=0.001），PSEN1p.G378E-/-组比 PSEN1p.G378E-/+组增加了23.6%（P=0.002）（表1，图2）。

2.2.3ACSL4蛋白的表达情况 WT组、PSEN1p.G378E-/+组和 PSEN1p.G378E-/-组的 ACSL4蛋白表达具有统计学意义 （F=256.262，P<0.001），PSEN1p.G378E-/+组与WT组的ACSL4蛋白表达量无明显差异 （P=0.115），PSEN1p.G378E-/-组的ACSL4的蛋白表达量是 WT组的2.69倍 （P<0.001），PSEN1p.G378E-/-组 是 PSEN1p.G378E-/+组2.33倍（P<0.001）（表1，图2）。

2.2.4PEBP1蛋白的表达情况 WT组、PSEN1p.G378E-/+组和 PSEN1p.G378E-/-组的 ACSL4蛋白表达具有统计学意义 （F=151.691，P<0.001），PSEN1p.G378E-/+组比WT组的PEBP1蛋白表达量增 加27.6%（P=0.001），PSEN1p.G378E-/-组 的PEBP1的蛋白表达量是 WT组的1.85倍 （P<0.001），PSEN1p.G378E-/-组 是 PSEN1p.G378E-/+组1.45倍（P<0.001）（表1，图2）。

3 讨论

2012年DIXON等[9]首次发现并报道了铁死亡这一新型细胞死亡方式，它在形态学、生化、遗传学方面不同于其他形式的细胞死亡。脂质过氧化是铁死亡的重要步骤，ACSL4参与磷脂酰乙醇胺或磷脂酰肌醇等带负电膜磷脂的合成，促进铁死亡[10-11]，YUAN等[12]发现 ACSL4通过增加具有脂毒性的5羟二十碳四烯酸的表达来促进铁死亡，可以作为铁死亡的标志物，ACSL4可通过脂质改变来抑制神经突触的生长[13]。PEBP1又称Raf激酶抑制蛋白（Raf kinase inhibitor protein,RKIP），通过与脂氧合酶结合，作用于磷脂酰乙醇胺，生成双/三氧化磷脂酰乙醇胺，导致铁死亡的发生[3-4]。PEBP1在早发型AD（early onset Alzheimer disease，EOAD）患者中的脑脊液中的表达增加[14]。与先前研究结果一致，我们发现ACSL4、PEBP1蛋白的表达纯合组均高于杂合组和野生组，结果提示可能与AD的疾病严重程度呈正相关，我们已经发现磷酸化的Tau蛋白表达情况纯合组均高于杂合和野生组（数据尚未发表）。

图1 小鼠的基因测序图（野生型：WT；杂合型PSEN1p.G378E-/+；纯合型PSEN1p.G378E-/-）

图2 铁死亡相关蛋白在三组小鼠海马中的表达情况

表1 海马中GPX4、SLC7A11、ACSL4及PEBP1蛋白的相对表达水平（n=10）

既往研究发现，GPX4敲除小鼠的脑组织中GPX4的表达降低，海马中可见神经元丢失、星形胶质细胞激活，病理特征同AD类似[15]。SLC7A11的主要作用为促进胱氨酸的吸收，排出谷氨酸，从而促进谷胱甘肽的合成，而谷胱甘肽是GPX4必需的辅助因子，当其合成受阻，导致GPX4活性降低，细胞抗氧化能力降低，促进铁死亡的发生[16]。谷胱甘肽表现出的抗氧化作用用于AD药物的研发[17]。与其结果不一致，我们发现GPX4、SLC7A11蛋白在PSEN1p.G378E敲入的AD小鼠海马中表达增加，可能提示GPX4和SLC7A11蛋白起到保护作用。目前铁死亡与AD的研究相对较少。ZHAGN等[18]对P301S tau转基因小鼠进行研究发现，α-硫辛酸可降低铁沉积、脂质过氧化、炎症反应、tau磷酸化，从而改善小鼠的学习认知能力。通过建立APP/PS1双转基因模型[19],使用铁螯合剂处理，表现出明显的脑保护作用并改善神经功能，表明铁死亡参与AD的发病过程。ACSL4、PEBP1、GPX4和SLC7A11蛋白具体如何发挥作用影响AD的发生，这尚需进一步研究。

本实验发现铁死亡相关蛋白（GPX4、SLC7A11、ACSL4、PEBP1）在PSEN1p.G378E敲入的 AD小鼠海马组织中的表达增加 （与正常小鼠相比），暗示铁死亡与AD有着或多或少的联系，但是其详细机制尚不清楚，对于铁死亡相关蛋白如何发挥作用促进AD的发生发展值得我们更进一步的研究，为AD的诊断与治疗策略提供可能。