笋芽顶端分生组织在竹秆横切面形态形成中的作用与机制研究

王雨珺 魏 强

(南京林业大学竹类研究所 南京 210037)

竹类是一种独特且重要的植物资源。竹笋可食，竹材可用，竹林还具有生长周期短、维护成本低等优点，因此具有巨大的经济价值。如今，全世界有近22亿人口的住房、食物以及经济收入依赖于竹产业；全球约有一半人口的生活和工作与竹产品的使用和贸易相关。目前，全球竹产业年贸易总额已经超过25亿美元，而人们对竹类资源的需求量仍在持续稳步增长。要满足人们对竹材资源日益增长的需求，就需要不断提高竹林资源的栽培效率，提高效率的基础则依赖于对这一独特的禾本科植物生长发育的深入研究和全面认识。

竹秆作为竹材中最具利用价值的部分，其形态建成主要分为笋芽的分化、笋芽初生增粗生长以及竹笋的高生长3个重要阶段。目前针对竹秆发育的研究大多集中在竹秆的高生长上，对笋芽增粗生长的研究极少。本团队前期通过对毛竹笋芽初生增粗生长过程及厚竹厚壁性状形成机制的研究发现，笋芽顶端分生组织(SAM)的形态和尺寸对于竹秆横切面外轮廓形态与壁-腔结构形成具有重要的作用。

为进一步深入研究笋芽顶端分生组织在竹秆发育中的作用及其机制，本研究选取了20种不同秆径的竹种，比较分析了这些竹种笋芽SAM的形态特征，并且对SAM的尺寸、细胞数以及原体/原套细胞数比值等指标与秆径值进行了相关性分析。此外，我们还针对一种SAM尺寸缩小，细胞数目减少并且原体/原套细胞数目比例失调的稳定变异体——实肚竹(Phyllostachysnidulariaf.farcta)(属于篌竹Ph.nidularia一种厚壁型稳定变异体)进行了系统的研究。

1 材料方法与数据处理

1.1 不同秆径竹种萌动芽SAM形态学比较分析

从南京林业大学竹种园(东经118°81′，北纬32°08′)中选取了20种不同秆径的散生竹(1,Pleioblastusargenteastriatus; 2,Shibataeachinensis; 3,Sasaellakongosanensis‘Aureostriatus’; 4,Chimonobambusasichuanensis; 5,Phyllostachysbissetii; 6,Pseudosasaamabilis; 7,Pseudosasajaponica; 8,Pleioblastusamarus; 9,Phyllostachysarcanaf.luteosulcata; 10,Semiarundinariasinica; 11,Phyllostachysglauca; 12,Brachystachyumdensiflorum; 13,Phyllostachysnigra; 14,Pleioblastusmaculatus; 15,Phyllostachysnidularia; 16,Indosasagigantea; 17,Sinobambusatootsik; 18,Phyllostachysnigravar.henonis; 19,Phyllostachysbambusoides; 20,Phyllostachysedulis)，每种竹随机测量30根长势中庸、无病虫害、健康完整的一年生竹秆地径，计算每种竹竹秆的平均地径。随后，挖取相应竹种萌动时期(S1时期)笋芽进行石蜡切片，每个竹种取5～10个生物学重复。通过石蜡切片，我们得到以上竹种笋芽的SAM纵切面形态，分别统计每种竹子笋芽SAM的高度、宽度、总细胞数、原套细胞数、原体细胞数以及原体/原套细胞数比值，将这些指标与对应竹种一年生竹秆平均地径进行相关性分析。结果显示，笋芽SAM的高度、宽度、总细胞数、原套和原体部分细胞数目以及原体/原套细胞数比值均随着秆径的增加而呈增大的趋势。其中，原体/原套的细胞数比值随着SAM总细胞数目的增加呈明显的线性增长。相关性分析显示，以上SAM所有形态指标与秆径均呈显著相关，其中原体细胞数与秆径的相关性系数最大(原文中图1所示)。结合Photoshop CS6、MATLAB以及R软件等分析工具，利用超椭圆方程对SAM外部轮廓进行拟合，结果表明笋芽SAM的外部轮廓形态在20个竹种中无明显差异，均呈指状(原文中图2所示)。

1.2 实肚竹笋芽SAM形态特征分析

选取实肚竹与其原种篌竹S1时期，S2时期(发育前期)，S3时期(发育中后期)笋芽作为SAM形态学比较分析的实验材料。2种笋芽均采集自其原始产地贵州省的荔波县(北纬25°29′，东经107°51′)。将3个不同发育时期的2种笋芽进行石蜡切片后，得到SAM的纵向切面图。利用超椭圆方程分别对3个发育时期的实肚竹及篌竹笋芽的SAM外部轮廓进行拟合，发现2种笋芽之间以及不同发育时期笋芽之间，其SAM均具有相似的轮廓形态(原文中图3所示)。进一步统计2种笋芽SAM的高度、宽度、高/宽比值、总细胞数目、原套细胞数、原体细胞数以及原体/原套细胞数比值后发现，实肚竹笋芽SAM较其原种篌竹具有尺寸缩小(高度、宽度、高/宽比值均降低)、细胞数目显著减少(总细胞数、原套细胞数及原体细胞数均显著降低)并且原体/原套细胞数比值显著降低的特点(原文中图3所示)。

1.3 实肚竹地下笋芽发育的细胞学过程

将实肚竹与篌竹3个发育时期(S1、S2、S3时期)的地下笋芽进行纵向石蜡切片观察，对比分析各个发育时期两种笋芽的细胞学特征，结果如原文图4所示：实肚竹S1时期笋芽中髓组织分化不明显，并且笋体中分化出了相对更多的壁组分组织(基本分生组织及肋状分生组织)。在后续的发育时期中，实肚竹笋芽髓组织发育迟缓，并且髓组织中出现明显的壁组分组织混入的紊乱现象(如原文图4展示)。进一步对实肚竹及篌竹S2时期笋芽的髓细胞进行亚细胞观察，发现其髓细胞的细胞壁形态曲折扭曲，胞间层及细胞间隙形态均发生变形(如原文图5展示)，暗示实肚竹髓组织在发育过程中受到异常机械力挤压。

1.4 实肚竹竹秆的形态及解剖学分析

分别选取实肚竹与篌竹1年生成熟竹秆作为形态学及解剖学分析的实验材料。将竹秆每个节间的横截面进行扫描(如原文图6-A,B,E展示)，结果显示实肚竹成熟竹秆节间具有多种竹壁加厚类型，一些疑似维管组织及基本组织出现在髓腔的中部。比较各节间横截面上竹壁与髓腔的面积比，发现实肚竹竹秆各节间横截面上的壁-腔面积比均显著大于篌竹(如原文图6-C展示)。利用超椭圆方程进行竹秆横截面外部轮廓的拟合分析，结果显示2种竹秆横截面外部轮廓形态相似(如原文图6-D)。选取2种竹秆各典型节间进行滑走切片以及扫描电镜观察。结果发现2种竹秆典型竹壁部分的解剖结构类似，实肚竹竹杆中的增生组织均为壁组分组织(维管组织及基本薄壁组织)，但位于髓腔中部的维管组织形态发育异常(如原文图6-E—K)。选取标准竹测量2种竹秆的秆高、枝下高、节数、胸径、地径、平均节间长、平均节间宽、平均壁厚、以及竹秆各部分生物量。比较结果显示，实肚竹竹秆的生物量较篌竹显著降低，形态学指标中除了平均壁厚显著高于篌竹之外，其他指标均显著小于篌竹(如原文图6-L, M)。

1.5 实肚竹与篌竹笋芽转录组比较分析

选取实肚竹与篌竹S1时期笋芽作为实验样品进行转录组测序，每种笋芽样品设置了5个生物学重复。所有笋芽样品均采集自贵州省荔波县(北纬25°29′，东经107°51′)。利用RNAprep Pure Kit (DP441)试剂盒对样品进行总RNA提取。提取到高质量RNA后，进行Strand-Specific RNA序列文库的构建和测序。利用Trimmomatic进行数据的过滤，即去除接头和低质量的序列，结果生成约1.41亿个高质量的read pairs，序列大小共约38 Gb。随后使用Bowtie将得到的序列片段(长度>40 bp)与核糖体RNA(rRNA)数据库进行对齐，删除比对成功的片段后使用带有默认参数的rnaSPAdes对序列进行重头组装。之后通过CD-HIT去除装配后的冗余片段，再利用BUSCO来对装配转录本进行评估，结果表明：组装的单基因捕获了核心保守植物基因的90.90%，完全捕获了核心保守植物基因的77.71%。所有样本的转录组谱在各个生物学重复中均具有较高的相关性(>0.9)。最后，利用BLASTx(e-value 为1e-5)在Swiss-Prot以及TrEMBL数据库中对序列信息进行注释。注释完成后，将通过RSEM(v1.2.31)获得的转录本原始计数输入edgeR包中鉴定差异表达基因(DEGs)(将P值小于0.05，表达倍数(log2)绝对值>0.5的转录本认为是DEGs)。结果得到844个DEGs。这些DEGs中有343个在实肚竹S1期笋芽中显著下调，有501个显著上调。利用MapMan(v.3.5.1R2)软件对差异基因进行可视化分析。结果显示：与原种(篌竹)的S1时期笋芽相比，实肚竹笋芽中多种细胞学过程相关基因发生了显著变化，如原文图7中展示：大量与植物内源激素代谢通路相关的基因，如脱落酸(ABA)、生长素(IAA)、油菜素内酯(BR)、赤霉素(GA)、茉莉酸(JA)相关基因在实肚竹S1时期笋芽中下调，而水杨酸(SA)相关基因则呈上调表达。此外，一系列与RNA转录调控相关的DEGs在实肚竹中显著下调，其中KNOTTED1likehomeobox，ELONGATOR和SIZ1等转录调控因子都曾被报道在茎顶端分生组织发育或细胞增殖和生长中发挥重要作用。此外，一些与“信号传导”通路相关的DEGs也在实肚竹S1时期笋芽中显著下调，如一系列与受体激酶、磷酸肌苷和MAPK激酶信号通路相关的基因。同时，如原文图8中所示：一系列下游功能基因，如与DNA合成与修复、细胞壁合成、糖分代谢、次生代谢、氨基酸代谢以及与细胞活动相关的基因在实肚竹笋芽中显著下调。在脂类代谢相关途径中，一些与脂类降解、脂肪酸合成及糖脂合成相关的基因均在实肚竹笋芽中显著上调，但其中与磷脂合成的相关基因却在变异体中下调。此外，一系列与氮代谢和糖酵解相关基因表达量在实肚竹中显著上调。大多数运输相关的基因，如糖分、磷酸盐、金属、钾和主要内在蛋白质运输相关基因也在实肚竹笋芽中显著上调表达。

1.6 转录组分析结果验证

从差异表达基因中挑选了12个候选基因进行了qPCR验证。这些基因包括：3个转录调控因子KNOX1，SIZ1和ELP1；5个分别与植物内源激素ABA、BR、GA、SA和JA信号通路相关的差异基因；1个与信号转导相关的基因；1个与次生代谢相关的基因；1个与纤维素合成相关基因以及1个与糖脂类合成相关基因。利用用于测序的RNA作为模板，通过TransScript© One-step gDNA Removal and cDNA Sythesis SuperMix 试剂盒进行cDNA的反转录。内参基因选用液泡膜内在蛋白基因Tonoplast intrinsic protein (TIP41)。qPCR验证结果显示12个差异基因表达趋势与转录组结果一致(如原文中图9所示)。

委托中国科学院遗传与发育生物研究所对实肚竹及其原种篌竹S1期笋芽中的CKs与IAA含量进行检测。结果如原文图10所示，除iPR外，实肚竹笋芽中所有检测到的其他CKs水平均明显低于篌竹。而IAA在实肚竹S1时期笋芽中丰度也显著小于其原种篌竹S1时期笋芽。

2 结论

竹类植物维持稳定的SAM外轮廓指状形态可能是其产生圆柱形竹秆的基础；与此同时SAM细胞数目、原套与原体细胞数量比例在竹秆秆径演化及正常壁-腔结构形成上应具有重要作用。实肚竹笋芽SAM与其原种篌竹相比，尺寸缩小、细胞数目减少，原体/原套细胞数目比例降低。这使得其由原体细胞分化而来的髓组织比例降低，而由原套细胞分化而来的壁组分组织比例增加。这2种组织比例的失衡使得壁组分组织在笋芽后续发育过程中易随机挤入髓组织中去，最终导致了实肚竹秆壁增厚且壁-腔结构多样化性状的形成。细胞数目减少的顶端分生组织也导致了实肚竹笋芽中CKs和IAA含量较低，同时一系列与激素相关基因及其下游靶标基因的下调表达最终导致了实肚竹竹秆矮化、秆径小且生物量低3种性状的形成。一部分与SAM维持及细胞分裂相关的转录调控因子，如KNOX1、ELPs和SIZ1在实肚竹笋芽中的下调可能是导致其SAM尺寸变小，细胞数目变少的分子原因。上述研究结果揭示了笋芽顶端分生组织外部形态、尺寸、细胞数目及原体/原套细胞数目比例在维持竹秆正常横切面形态(圆形外部轮廓，秆壁围绕髓腔呈规则环形分布的正常壁-腔结构)发育中的重要作用。此外，本研究还揭示了一系列与此过程相关的候选调控基因，为后续针对竹秆发育的深入研究奠定了较好的基础。

原 文 出 处

Wang Y, Sun X, Ding Y,Fei Z, Jiao C, Fan M, Yao B, Xin P, Chu J, Wei Q. Cellular and molecular characterization of a thick-walled variant reveal a pivotal role of shoot apical meristem in transverse development of bamboo culm. Journal of Experimental Botany. 2019 Apr 30. doi:10.1093/jxb/erz201.