上海地区健康猪群中副猪嗜血杆菌的分离鉴定

宁 昆 沈莉萍 徐 锋

（上海市动物疫病预防控制中心， 上海 201103）

副猪嗜血杆菌病又称猪革拉斯病，是由副猪嗜血杆菌（Haemophilus parasuis, HPS） 引起猪的一种以高热、呼吸道紊乱、关节肿胀、中枢神经症状及高死亡率为特征的疾病。该病在临床上以多发性关节炎和浆膜炎为主要病变特征，又称多发性纤维素性浆膜炎和关节炎。HPS 血清型众多，可分为15 个血清型，命名为1～15 型，另有约20%分离株尚不能分型。HPS 属于典型的“机会主义”病原，在机体遭受应激或感染病毒性疾病（如高致病性猪蓝耳病、圆环病毒感染、猪瘟）导致免疫力下降时，可以侵入机体引起发病[1]。本菌可使2周龄到4 月龄的猪感染发病，尤其以5 周龄至8 周龄断奶前后和保育阶段的猪比较常见，发病率10%～15%，病死率可达50%[2]，给养猪业带来重大经济损失，严重威胁着全世界养猪业的健康发展。

本研究通过对上海地区健康猪群进行监测，以期了解副猪嗜血杆菌在健康猪群中的携带情况，为上海地区副猪嗜血杆菌病的防控提供技术支持。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 样品来源

2018 年在上海2 个规模化猪场采集猪唾液20 份、猪鼻拭子60 份。所采集的样品经保温箱运回实验室，当天进行检测。

1.1.2 培养基和试剂

胰蛋白胨大豆琼脂（TSA）、Columbia 血琼脂基础购自BD 公司，辅酶I（NAD）购自上海如吉生物科技发展有限公司；无菌脱纤维羊血购自杭州新锐生物工程有限公司；小牛血清购自Thermo 公司；Premix 购自TaKaRa 公司；引物由上海桑尼生物科技有限公司合成；质谱样品处理基质液（VITEK MS-CHCA）购自生物梅里埃公司；微量生化鉴定管购自杭州滨和微生物试剂有限公司。

1.1.3 标准菌株

副猪嗜血杆菌HP80 由中国农业科学院哈尔滨兽医研究所惠赠，金黄色葡萄球菌ATCC 25923、大肠埃希菌ATCC 8739 购自ATCC。

1.1.4 仪器

全自动快速微生物质谱检测系统（VITEK MS）购自生物梅里埃公司；PCR 仪（PTC-200）购自伯乐公司；恒温箱购自Thermo 公司。

1.2 方法

1.2.1 细菌分离培养

在生物安全柜中用接种环蘸取样品，划线接种于含5%小牛血清和0.1 g/mL 的TSA 平板上，于37℃培养48 h；挑取可疑菌落进行革兰氏染色；挑取可疑菌落，接种于含5%小牛血清和0.1 g/mL 的TSA 平板进行纯培养。

无菌挑取纯培养后的菌落，平行划线于无NAD 的绵羊血平板上，再挑取金黄色葡萄球菌垂直于水平线划线接种，于37℃培养24～48 h，观察菌落生长情况。

1.2.2 细菌的生化、PCR 和质谱鉴定

挑取可疑菌落分别接种于葡萄糖、乳糖、半乳糖、甘露醇和木糖微量生化鉴定管中，鉴定管中每管按10 μg/mL 终浓度的NAD，于37℃培养24 h。同时，对可疑菌落进行硝酸盐还原试验、尿素酶试验和氧化酶试验。

挑取3～5 个可疑菌落于含100 μL 去离子水的离心管中，100℃水浴10 min，8 000 r/min 离心5 min，吸取上清作为模板。使用笔者团队设计的副猪嗜血杆菌16s rRNA 引物（见表1）进行扩增。副猪嗜血杆菌反应体系如下：premix 12.5 μL，DEPC 水8.5 μL，上下游引物各1 μL，模板2 μL；反应条件为：95℃2 min；94℃30 s，58℃1 min，72℃1.5 min，扩增33 个循环；72℃延伸10 min。

于鉴定前一天接种副猪嗜血杆菌HP80 和质控株ATCC 8739，使用全自动快速微生物质谱检测系统（VITEK MS） 按照操作步骤对HP80、ATCC8739 和可疑菌落进行鉴定，读取鉴定结果。

2 结果

2.1 分离培养

经48 h 培养，TSA 平板上生长出的可疑菌落直径约1～2 mm，不溶血、半透明、圆形隆起、边缘整齐、光滑湿润。经革兰氏染色，可疑菌落呈革兰氏阴性短杆状，大小约0.5 μm×（1.5～2.0） μm。将可疑菌落纯培养，24 h 后出现上述菌落形态。

可疑菌落和金黄色葡萄球菌一起培养后出现“卫星生长现象”，即在金黄色葡萄球菌旁边的可疑菌落较大，远离金黄色葡萄球菌的可疑菌落较小。

2.2 鉴定

可疑菌落的生化试验结果见表2，可以看到，所分离的细菌发酵葡萄糖、半乳糖，不发酵乳糖、甘露醇和木糖。触酶试验阴性，硝酸盐还原试验阳性，尿素酶试验阴性，氧化酶试验阴性。

表2 细菌的生化反应结果

PCR 检测结果见图1，可疑菌落出现275 bp 的目的条带，20 份猪唾液中检测出1 份阳性，60 份猪鼻拭子中检测出5 份阳性。

使用VITEK MS 对可疑菌落进行蛋白质谱鉴定，见图2，结果与数据库中的副猪嗜血杆菌同源性达到75%以上。综合上述分离鉴定结果，判定为副猪嗜血杆菌。

图1 副猪嗜血杆菌的PCR 鉴定结果

图2 副猪嗜血杆菌的质谱鉴定图

3 讨论

副猪嗜血杆菌病相对于其他疾病较难防控的原因有：一是目前该菌已确定的血清型有15 种，各血清型之间的交叉保护力较弱或者没有。有研究表明，已经接种过灭活菌苗的猪群也会因缺乏交叉保护而致免疫失败。二是该菌属于机会性致病菌，在猪群整体状态较好时不发病，容易被猪场管理者忽视，但是在猪群存在猪蓝耳病或圆环病毒病时，HPS 易继发感染，该菌的分离率会增加[3]；或者在猪群遇到气温骤降、运输等应激条件下，也会增加感染的风险[4]。因此，防治本病的前提是做好饲养管理，提高猪群免疫力，采取疫苗加抗生素相结合的综合防控措施。具体来讲，需要做到如下几点。

一是加强饲养管理，改善饲养条件。保育阶段是猪发生副猪嗜血杆菌病的高发年龄段，在仔猪断奶后到保育舍时，由于保育舍温度较低，仔猪受到寒冷应激之后抵抗力下降，此时容易感染副猪嗜血杆菌这类条件致病菌。所以在转舍时，将保育舍的温度提高到同产房的温度，而后每天缓慢降低。

二是做好免疫抑制性疾病的预防。副猪嗜血杆菌常继发于圆环病毒病、蓝耳病和支原体肺炎等免疫抑制性疾病，所以对于本病的预防应该从这几种病入手，做到及时免疫。

三是合理使用药物。副猪嗜血杆菌对恩诺沙星、头孢噻呋等比较敏感。对于本病的治疗应该尽早，如果在发病后期则治愈率较低。同时，在治疗时一定要找到病因，找到原发病，然后配合该菌的敏感药物就可以较好地治愈本病。