疫苗中和抗体效价-时间曲线下面积在猪瘟疫苗免疫效果评价中的应用

韩永刚 刘 浩 赵 毅

（1 陕西省汉中市汉台区畜牧兽医技术推广中心， 陕西 汉中 723000； 2 陕西省动物卫生与屠宰管理站， 陕西 西安 710000；3 陕西省动物疫病预防控制中心， 陕西 西安 723000）

猪瘟（Classical Swine Fever, CSF）是由猪瘟病毒引起的一种猪的高度接触性、出血性和致死性传染病，该病传染性强、致死率高，严重威胁着养猪业的发展。世界动物卫生组织将其列为必须报告的动物疫病，中国将其列为一类动物疫病。《国家中长期动物疫病防治规划（2012—2020 年）》 及《国家猪瘟防治指导意见（2017—2020 年）》提出要求：到2020 年底，全国所有种猪场和部分区域达到猪瘟净化标准，并进一步扩大猪瘟净化区域范围。

猪瘟净化的标准是指“连续24 个月以上，种猪场、区域内无猪瘟临床病例，猪瘟病毒野毒感染病原学检测阴性”。目前，普通猪场在净化猪瘟的过程中，首先将其建成为猪瘟稳定控制场，即在猪场内采用猪瘟病毒E2蛋白灭活疫苗免疫6～8 个月，当传统猪瘟C 株活疫苗免疫产生的E0 抗体完全消失后，淘汰场内所有猪瘟野毒感染产生的E0 抗体阳性的猪只。显然，使用猪瘟病毒E2 蛋白灭活疫苗对猪场内所有猪只进行免疫是建立猪瘟稳定控制场的一项必要的步骤。

猪瘟病毒E2 蛋白灭活疫苗产品中的猪瘟病毒E2 蛋白含量尽管符合官方标准，但由于存在生产工艺、生产批次的差异，疫苗中抗原蛋白空间构象、抗原含量不尽相同，疫苗在猪只体内达到的免疫效果会有一定差异，进而影响临床上猪瘟净化工作。因此，开展不同来源、批次的猪瘟病毒E2 蛋白灭活疫苗及猪瘟C 株活疫苗产品临床免疫效果评价，是猪瘟净化的必要工作。

血药浓度- 时间曲线下面积（Area Under the Curve,AUC）指血药浓度随时间变化的动态过程，以血药浓度为纵坐标，以时间为横坐标绘制的曲线与横坐标轴之间的面积。AUC 代表药物的生物利用度，AUC 大则生物利用度高，反之则低。AUC0-∞指药物从零时间至所有原形药物全部消除这一段时间的药时曲线下总面积，反映药物进入血循环的总量[1]。它代表一次用药后的吸收总量，反映药物的吸收程度。同一受试者，AUC大，表示吸收利用程度大。生物利用度研究就是在同一受试者中比较两个制剂AUC 的大小。与此评价有关的指标还包括血药浓度达峰时间（peak time,Tmax）和血浆药物达峰浓度（peak concentration,Cmax），通常用AUC反映药物的吸收程度，以Cmax和Tmax的大小综合反映药物制剂的吸收、分布、排泄和代谢情况。在同一受试者中，Cmax和Tmax主要与药物制剂有关。

为了探求一种系统、严格且较为准确的免疫效果的血清学评价方法，以猪瘟病毒E2 蛋白灭活疫苗免疫中和抗体效价代替血药浓度，建立了抗体效价-时间曲线下面积指标，进行猪瘟疫苗免疫效果的血清学综合评价，以优选猪瘟疫苗，促进猪瘟净化的实施和完成。

1 具体实施方法

为便于更好地理解技术评价方案，以下结合已有的中和抗体检测数据对本方案作进一步的详细说明。

1.1 建立基准曲线

选定一个猪瘟净化达标的猪场W 或SPF 无特定病原猪场，在该猪场内建立一个猪瘟病毒E2 蛋白灭活疫苗免疫效果评价的基准曲线Q，基准曲线Q 的建立按照下述步骤依次完成，

⑴商品猪免疫标准的猪瘟病毒E2 蛋白灭活疫苗后，在0、14、28、56、84、112、140、168、196 日采集血样，每个采样日的血样为3～5 份，分离血清后冷冻保存。

⑵检测血清样品的中和抗体效价，计算每个采样日多份血清样品中E2 抗体效价的平均值H，见表1。

⑶将表1 中各数据代入计算公式Sn=（Hn＋Hn-1）×L/2，计算相邻两个采样日H 值两点连线下的面积Sn，式中：n 为采样日，n-1 为上一个采样日，Hn为某个采样日E2 抗体效价的平均值，Hn-1为上一个采样日E2 抗体效价的平均值，L 为相邻两个采样日之间的间隔天数。

例如，采样日n 为14，Hn为H14=4.0，Hn-1=H0=3.2，L=14-0=14，则S14=（H14＋H0） ×L/2=（4.0 ＋3.2） ×14÷2=50.4；采样日n 为28，Hn为H28=6.0，Hn-1=H14=4.0，L=28-14=14，则S28=（H28＋H14）×L/2=（6.0＋4.0）×14÷2=70；采样日n 为112，Hn为H112=12.0，Hn-1=H84=11.2，L=112-84=28，则S112=（H112＋H84） ×L/2=（12.0＋11.2）×28÷2=324.8；将表1 中其余各数据带入上述公式计算，即可得到如下表1 所列相应数据。

⑷将表1 中的各个Sn数据带入计算公式Mn=Sn＋Sn-1＋Sn-2＋…中，计算出对应于各采样日猪瘟E2 抗体效价-时间曲线下累加面积Mn，式中：Sn-1为上一个采样日的E2 抗体效价的平均值与它前一个采样日的E2 抗体效价的平均值两点连线下的面积，Sn-2为n-2 采样日的E2 抗体效价的平均值与它前一个采样日的E2 抗体效价的平均值两点连线下的面积，

例如，采样 日n 为14，Sn为S14，Sn-1为S0，则Mn=M14=S14＋S0=50.4＋0=50.4；采样日n 为28，Sn为S28，Sn-1为S14，则Mn=M28=S2＋S14=70.0＋50.4=120.4；采样日n 为56，Sn为S56，Sn-1为S28，Sn-2为S14，则Mn=M56=S56＋S28＋S14=S56＋M28=189.0 ＋120.4=309.4；将表1 中其余各数据带入上述计算式，即可得到如下表1 所列相应数据。

表1 猪瘟净化达标场内猪瘟E2 灭活疫苗A 免疫中和抗体效价均值Hn[2]、 中和抗体效价-时间曲线下面积Sn 以及中和抗体效价-时间曲线下累加面积Mn 数值表

⑸以采样日n 为横坐标，病毒E2 蛋白灭活疫苗A抗体效价-时间曲线下面积累加值Mn为纵坐标，即生成在猪瘟净化达标猪场W 内商品猪免疫标准的猪瘟病毒E2 蛋白灭活疫苗后建立的疫苗免疫效果评价基准曲线Q，如图1。

该基准曲线采用EXCEL 制表软件拟合多项式为：Y=0.012X2＋7.3797X-93.095

其中：X 为采样日距E2 疫苗免疫日的间隔天数，Y为采样日的E2 疫苗免疫抗体效价-时间曲线下面积累加值，R2为多项式与散点图拟合度，取值范围0≤R≤1，R=1 时为完全重合。

图1 猪瘟病毒E2 蛋白灭活疫苗免疫效果评价基准曲线

1.2 建立参比曲线

在猪场W 内，参照基准曲线建立过程，建立一个猪瘟病毒C 株活疫苗B 免疫效果评价的参比曲线P1，P1的数据及建立过程见表2。

⑴商品猪免疫待评估的猪瘟病毒C 株活疫苗B 后，在0、14、28、56、84、112、140、168、196 日采集血样，每个采样日的血样为3～5 份，分离血清后冷冻保存。

⑵与1.1⑵步骤相同，计算每个采样日多份免疫猪瘟活疫苗B 血清样品中和抗体效价的平均值H，见表2。

⑶将表2 中各H 数据代入计算公式Sn=（Hn＋Hn-1）×L/2，计算免疫猪瘟活疫苗B 后各采样日中和抗体效价的平均值与它前一个采样日的E2 抗体效价的平均值两点连线下的面积Sn，将表2 中其余各数据带入上述公式计算，即可得到表2 所列数据。

⑷将表2 中各Sn数据带入计算公式Mn=Sn＋Sn-＋Sn-2＋…中，计算对应于各采样日免疫猪瘟活疫苗B 抗体效价-时间曲线下累加面积Mn。将表2 中其余各数据带入上述计算式，即可得到表2 所列数据。

⑸以采样日n 为横坐标，免疫猪瘟活疫苗B 中和抗体效价-时间曲线下面积累加值Mn为纵坐标，即生成在猪场W 内使用待评估的猪瘟病毒C 株活疫苗B 的免疫效果评价参比曲线P1，如图2。表2 猪瘟净化达标场内猪瘟活疫苗B 免疫抗体效价均值Hn[2]、 中和抗体效价-时间曲线下面积Sn、 中和抗体效价-时间曲线下累加面积Mn数值表

图2 待评估的猪瘟病毒C 株活疫苗B 的免疫效果评价参比曲线

表2 猪瘟净化达标场内猪瘟活疫苗B 免疫抗体效价均值Hn[2]、 中和抗体效价-时间曲线下面积Sn、 中和抗体效价-时间曲线下累加面积Mn 数值表

1.3 指标对比

将参比曲线P1 与基准曲线Q 放在同一坐标系内，如图3 所示，先做几何学初步判定，然后做统计学判定。

1.3.1 几何学初步判定方法

先看参比曲线与基准曲线的重合度，再看参比曲线是在基准曲线的左上侧还是右下侧，最后看参比曲线中免疫112 天后的线段是否有相对于基准曲线向下偏离的形态，若重合度严重不好的，基本断定为该疫苗与E2基准疫苗免疫效果相差较大。

图3 参比曲线P1 与基准曲线Q 在同一坐标系的比较图

1.3.2 统计学判定方法

对于与基准曲线重合度较好的参比曲线，即处于基准曲线的左上侧，或虽处于基准曲线右下侧却十分接近基准曲线，而且参比曲线中免疫112 天后的线段相对于基准曲线没有明显向下偏离的参比曲线，将参比曲线112 天后的Mn与基准曲线上对应的Mn两者进行统计学方差分析，若差异不显著，即P＞0.05 的，可判定为该猪场的猪瘟疫苗免疫效果达标，进而即可确定该猪场使用的猪瘟疫苗合格；如果差异显著，即P＜0.05 的，可判定为该猪场的猪瘟疫苗免疫效果不达标，进而即可确定不宜在猪场使用该猪瘟疫苗。

从图3 中可以看出，参比曲线P1 处于基准曲线Q的右下侧，且距离较远，属于重合度严重不好的类型，免疫112 天后呈现明显向下偏离标准基线的形态。因此可以初步判定为该猪瘟病毒C 株活疫苗B 免疫效果（中和抗体效价） 与猪瘟病毒E2 蛋白灭活疫苗差异明显。再做进一步统计学判定，活疫苗B 与E2 灭活疫苗A 免疫112 天后指标数据经方差分析为T=2.9482，P＜0.05，差异显著，可进一步断定活疫苗B 与猪瘟病毒E2 蛋白灭活疫苗A 血清学免疫效果差异显著。

按照本研究评价方法，可以对多种待销售的和已经上市的猪瘟疫苗的免疫效果做出准确的判定。

2 结果讨论

⑴猪瘟综合控制是一项复杂的工程，免疫预防是目前控制猪瘟的重要手段，在使用疫苗的同时，应配合良好的检测手段和科学的评价方法，以群体抗体水平来评价和优化免疫程序才能保证猪瘟免疫效果。以净化种公猪、种母猪和后备母猪为主，淘汰猪瘟病原阳性猪和抗体阴性猪，结合调整猪瘟免疫程序，加强隔离消毒、设施改善、环境治理等综合性措施、协同控制其他疫病的综合控制措施对我国比较实用[3]。

⑵猪瘟疫苗种类多，抗原含量差距较大，且C 株疫苗免疫后，可很快诱导细胞免疫，免疫早期虽然检测不到中和抗体，但猪却能抵抗强毒的攻击，说明免疫早期细胞免疫的作用更加重要[4,5]。如果接种后晚些时间攻毒，猪群中和抗体水平与攻毒保护之间呈一定相关性[6,7]。因此规模化猪场制定免疫程序最好以群体抗体检测结果为依据。另外母猪群的免疫水平及均匀性直接关系到仔猪群的群体免疫效果，因此做好种猪群免疫，对稳定仔猪免疫水平非常重要。

⑶以采样日为横坐标，猪瘟疫苗中和抗体效价-时间曲线下累加面积为纵坐标的猪瘟疫苗抗体效价-时间曲线下面积-时间图，将生物制品免疫效价水平和效价持续时间相结合，组成了效价-时间复合指标，弥补了猪瘟疫苗单纯抗原含量测定评价方法的不足，并将免疫效价高低评价一维体系推进到二维空间，因此提高了免疫评价结果的准确性。

⑷建立的指标曲线，即基准曲线和参比曲线清楚地表现了不同疫苗产品在免疫效果上的差异，为用户选用猪瘟疫苗开展猪瘟免疫净化提供了直观的对比依据。

⑸对于使用同一批次猪瘟病毒E2 蛋白灭活疫苗免疫的不同猪场，基于本方案建立的指标曲线真实地反映了相应猪场在这一指标上的差异，可用以评估各猪场生物安全管理水平及猪场猪群免疫系统功能受外界综合免疫抑制因素如免疫抑制病、霉菌毒素等影响的程度。

⑹本方案是一种严格的中和抗体血清学评价方法，具有很高的准确性，通过猪场的猪瘟病毒E2 蛋白灭活疫苗免疫效果评价，在各猪场的生物安全管理水平及猪场猪群免疫系统功能一致的状况下，可以判定某种猪瘟病毒E2 蛋白灭活疫苗产品的优劣，从而为该种疫苗的选择提供了准确且可靠的方法，进而可促进猪瘟净化的实施和完成。同时可以为基于猪瘟病毒E2 蛋白灭活疫苗及其配套技术达到的猪瘟稳定控制猪场是否达到猪瘟净化标准的问题的自动化判断奠定了必要的技术理论及物质基础，并降低猪瘟稳定控制场发病的风险，对国家提出猪瘟净化目标的早日实现具有十分重要的现实意义。