环草石斛多酚成份及其生物活性*

李雪文，陈慧萍，何伟波，杨文铃，倪飞雨，黃子雯，胡海燕，王军

(中山大学药学院，广东 广州 510006)

2型糖尿病是一个复杂的代谢疾病，胰岛素抵抗与胰岛β-细胞功能障碍是2型糖尿病发病的主要病理基础。炎性因子介导的慢性非特异性低度炎性反应状态与胰岛素抵抗及β-细胞功能障碍密切相关[1-2]。氧化应激与糖尿病及其并发症的发生发展关系密切，人体在高血糖、高游离脂肪酸的刺激下会启动氧化应激，氧化应激信号通路的激活又导致胰岛素抵抗，胰岛素分泌受损，糖尿病血管病变。氧化应激与高血糖相互促进，是糖尿病难以治愈的原因之一[3-4]。中药石斛治疗糖尿病、改善并发症的疗效已被中医临床证实。张捷平等[5-6]报道“石斛合剂”(石斛，黄芪，五味子，丹参)能降低2型糖尿病人的血糖、血脂，减轻胰岛素抵抗。其降糖机制可能部分与抑制α-葡萄糖苷酶活性有关。文献[7]报道鼓槌石斛乙醇提取物可明显改善糖尿病大鼠视网膜病变。课题组前期对环草石斛的植物化学研究，发现了4个具有强抑制α-葡萄糖苷酶活性的新二聚多酚[8]。为了更深入探索石斛治疗糖尿病的药效物质，本文对环草石斛进行了抗氧化、α-葡萄糖苷酶抑制活性及抗炎活性的酚类成分研究。在此报道15个酚类化合物的分离纯化及其抗氧化、α-葡萄糖苷酶抑制、抗炎等活性评价结果，为进一步研究中药石斛的抗糖尿病机制提供依据。

1 实验部分

1.1 仪器与材料

Bruker Avance III 400 MHz核磁共振谱仪(瑞士Bruker BioSpin公司)；Bruker Ascend TM 500 MHz核磁共振谱仪(德国Bruker公司)；Bruker Avance III 600 MHz核磁共振谱仪(瑞士Bruker BioSpin公司)；TSQ QUANTUM ACCESS MAX型液相色谱-质谱联用仪(美国Thermo Fisher Scientific公司)；Essentia SPD-16型高效液相色谱仪(HPLC)(日本Shzmadzu公司)；Flexstation 3多功能酶标工作站(美国Moleculardevices公司)；Thermo 311 CO2培养箱(美国Thermo Fisher Scientific公司)。

薄层层析硅胶板(GF254)、柱层析硅胶(200-300目)均为青岛海洋化工有限公司产品；Sephadex LH-20凝胶为美国GE Healthcare产品；C-18反相硅胶ODS-A为日本Daiso公司产品；色谱纯甲醇为Merck产品；石油醚、乙酸乙酯、丙酮等试剂均为分析纯，为广州化学试剂厂产品。1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(DPPH)、白藜芦醇、维生素C、L-NG-monomethyl-L-arginine(L-NMMA)购自阿拉丁；胎牛血清为美国gibco产品；NO测定试剂盒、MTT测定试剂盒购自碧云天生物试剂有限公司；α-葡萄糖苷酶、硝基苯酚-α-葡萄糖苷购自Sigma公司。

环草石斛饮片于2015 年 9 月购自广州采芝林药店；该药材产自云南，广州市药材公司中药饮片厂监制；购买后经中山大学药学院蒋林研究员用经典方法鉴定。

1.2 提取与分离

取环草石斛饮片 1 kg，以φ= 80%丙酮溶液室温提取，照料液比为1∶15；提取次数为3次，每次浸提3 d，每天超声辅助提取80 min。滤出提取液，合并后减压旋干，称重，得浸膏70 g。浸膏经ODS-C18反相柱富集，水洗除糖，再用甲醇洗脱，收集甲醇洗脱液，得到多酚富集物。多酚富集物采用硅胶柱色谱分离，石油醚-乙酸乙酯梯度洗脱，分段收集，得洗脱液1(乙酸乙酯-石油醚10∶90-25∶75)、洗脱液2(乙酸乙酯-石油醚25∶75-35∶65)、洗脱液3(乙酸乙酯-石油醚35∶65-50∶50)、洗脱液4(乙酸乙酯-石油醚50∶50-80∶20)、洗脱液5(乙酸乙酯-石油醚80∶20-90∶10)；分别浓缩各部位洗脱液，得到馏分Fr.1-Fr.5。各馏份经HPLC分别纯化，水-甲醇梯度洗脱(水-甲醇100∶0→20∶80)，分别收集峰形分离较好的馏出液，减压旋干，再经Sephadex LH-20凝胶柱分别纯化，甲醇洗脱，得到纯的单体化合物。从Fr.1中分离得到化合物4(5.2 mg)、13(1.5 mg)、8(26.8 mg)，从Fr.2中分离得到化合物5(5.8 mg)、6(1.5 mg)、7(11.1 mg)、从Fr.3中分离得到化合物2(3.8 mg)、9(2.5 mg)、11(31.5 mg)、12(75.8 mg)，从Fr.4中分离得到化合物1(5.8 mg)、10(3.6 mg)、14(4.2 mg)、15(1.8 mg)，从Fr.5中分离得到化合物3(2.5 mg)。

1.3 化合物波谱数据

化合物1，chrysotoxol A[9]，棕色无定型粉末，易溶于甲醇，丙酮；ESI-MSm/z：405.6 [M-H]-;1H NMR (400 MHz, aceton-d6)δH：6.39 (1H, s, H-3), 8.22 (1H, d,J= 8.4 Hz, H-5 ), 6.68 (1H, m, H-6), 6.71 (1H, d,J= 2.1 Hz, H-8), 2.65 (4H, m, H-9, 10), 3.00 (1H, dd,J= 5.6, 15.8 Hz, H-11α), 2.67 (1H, dd,J= 5.6, 15.8 Hz, H-11β), 4.09 (1H, m, H-12), 4.59 (1H, d,J= 8.2 Hz, H-13), 7.04 (1H, s, H-15), 6.82 (1H, d,J= 8.1 Hz, H-18), 6.91 (1H, d,J= 8.2 Hz, H-19), 3.85 (3H, s, CH3-20)。

化合物2，neoechinulin A[10]，黄色固体，易溶于甲醇，丙酮；1H NMR (400 MHz, aceton-d6)δH：7.94 (br, NH-1), 7.30 (1H, d,J= 7.6 Hz, H-4), 7.11 (1H, t,J= 7.4 Hz, H-5), 7.05 (1H, t,J= 7.6 Hz, H-6), 7.40 (1H, d,J= 7.6 Hz, H-7), 7.05 (1H, s, H-8), 7.42 (br, NH-11), 4.27 (1H, q,J= 7.2 Hz, H-12), 7.55 (br, NH-14), 6.14 (1H, dd,J= 10.4, 17.6 Hz, H-16), 5.11 (1H, d,J= 17.6 Hz, H-17α), 5.07 (1H, d,J= 10.4 Hz, H-17β), 1.56 (6H, s, H-18, 19), 1.52 (3H, d,J= 7.2 Hz, H-20);13C NMR (100 MHz, aceton-d6)δc: 144.6/144.7 (C-2), 104.4/104.5 (C-3), 127.2/127.2 (C-3a), 119.7 (C-4), 120.7 (C-5), 122.1 (C-6), 110.6/110.6 (C-7), 136.0/136.2 (C-7a), 111.1 (C-8), 123.0 (C-9), 166.8/166.8 (C-10), 52.1/52.2 ((C-12), 160.2/160.2 (C-13), 40.0 (C-15), 145.9 (C-16), 112.3/112.4 (C-17), 27.9 (C-18,19), 20.6/20.6 (C-20)。

化合物3，3,6,9-三羟基-3,4-二氢蒽-1(2H)-酮[11]，白色固体，易溶于丙酮，甲醇；ESI-MSm/z：243.3 [M-H]-；1H NMR (500 MHz, Methanol-d4)δH：2.71 (1H, dd,J= 8.0, 16.0 Hz, H-2α), 2.98 (1H, dd,J= 4.0, 16.0 Hz, H-2β), 4.33 (1H, m, H-3), 3.29(1H, dd,J= 3.6, 16.0 Hz, H-4α), 3.05 (1H, dd,J= 8.0, 16.0 Hz, H-4β), 7.58 (1H, d,J= 2.8 Hz, H-5), 7.19 (1H, dd,J= 2.8, 9.2 Hz, H-7), 9.35 (1H,J= 9.2 Hz, H-8), 6.67 (1H, s, H-10);13C NMR (125 MHz, Methanol-d4)δc：199.6 (C-1), 50.4 (C-2), 67.4 (C-3), 41.3 (C-4), 145.8 (C-4a), 105.8 (C-5), 155.8 (C-6), 121.6 (C-7), 129.3 (C-8), 127.8 (C-8a), 160.2 (C-9), 120.4 (C-9a), 110.3 (C-10), 129.2 (C-10a)。

化合物4，4,4′-二羟基-3,5-二甲氧基联苄[12]，白色固体，易溶于丙酮，甲醇，氯仿；1H NMR (400 MHz, aceton-d6)δH：6.47 (2H, s, H-2, 6), 7.01 (2H,J= 8.8 Hz, H-2′, 6′), 6.72 (2H,J= 8.8 Hz, H-3′, 5′), 3.77 (6H, s, CH3O-3,5), 2.78 (4H, m, H-a, a′);13C NMR (100 MHz, aceton-d6)δc：133.2 (C-1), 106.8 (C-2, 6) , 148.5 (C-3, 5), 134.9 (C-4), 133.5 (C-1′), 130.2(C-2′, 6′), 115.8 (C-3′, 5′), 156.3 (C-4′), 56.5 (CH3O-3,5), 39.1 (C-a), 38.1 (C-′a)。

化合物5，柚皮素[13]，黄色粉末，易溶于丙酮，甲醇；1H NMR (600 MHz, aceton-d6)δH：5.43 (1H, m, H-2), 3.15 (1H, dd,J= 13.2, 17.4 Hz, H-3α), 2.70 (1H, dd,J= 3.0, 17.8 Hz, H-3β), 5.95 (1H, s, H-6), 5.94 (1H, s, H-8), 7.38 (2H, d,J= 8.4 Hz, H-2′, 6′), 6.89 (2H, d,J= 8.4 Hz, H-3′, 5′);13C NMR (150 MHz, aceton-d6)δc：79.8 (C-2 ), 43.5 (C-3), 196.9 (C-4), 165 (C-5), 96.9 (C-6), 168.8 (C-7), 96.0 (C-8), 164.4 (C-9), 102.9 (C-10), 130.9 (C-1′), 129 (C-2′,6′), 116.1 (C-3′, 5′), 158.7 (C-4′)。

化合物6，4′,5-二羟基-3′,5,′7-三甲氧基黄烷酮[14]，白色粉末，易溶于丙酮，甲醇；ESI-MSm/z：345.3 [M-H]-；1H NMR (400 MHz, aceton-d6)δH：5.48 (1H, m, H-2), 3.21 (1H, dd,J= 13.2, 17.2 Hz, H-3α), 2.78 (1H, dd,J= 3.2, 17.2 Hz, H-3β), 5.97 (1H, d,J= 1.6 Hz, H-6), 5.99 (1H, d,J= 1.6 Hz, H-8), 6.90 (2H, s, H-2′, 6′), 3.75 (3H, s, CH3O-7), 3.89 (6H, s, CH3O-3′,5′), 12.16 (s, HO-6)。

化合物7，5,7,4′-三羟基-3′,5′-二甲氧基黄烷酮[15]，无色片晶，易溶于丙酮，甲醇；ESI-MSm/z：331.5 [M-H]-；1H NMR (400 MHz, aceton-d6)δH：5.41 (1H, m, H-2), 3.22 (1H, dd,J= 12.4, 16.8 Hz, H-3α), 2.72 (1H, dd,J= 2.8, 16.8 Hz, H-3β), 5.95 (1H, d,J= 2.0 Hz, H-6), 5.97 (1H, d,J= 2.0 Hz, H-8), 6.88 (2H, s, H-2′, 6′), 3.86 (6H, s, CH3O-3′, 5′), 12.18 (s, HO-6)。

化合物8，batatasin-III[16]，黄色油状物，易溶于丙酮，甲醇，氯仿；1H NMR (400 MHz, aceton-d6)δH：6.33 (1H, s, H-2), 6.24 (1H, s, H-4), 6.31 (1H, s, H-6), 6.71 (1H, s, H-2′), 6.65 (1H, d,J= 7.6 Hz, H-4′), 7.08 (1H, t,J= 7.6 Hz, H-5′), 6.70 (1H, d,J= 7.6 Hz, H-6′), 2.78 (4H, m, H-a, a′), 3.70 (3H, s, MeO-5), 8.29 (HO-H);13C NMR (100 MHz, aceton-d6)δc：145.1 (C-1), 108.7 (C-2), 159.3 (C-3), 99.7 (C-4), 161.8 (C-5), 106.2 (C-6), 144.3 (C-1′), 116.1 (C-2′), 158.2 (C-3′), 113.6 (C-4′), 130 (C-5′), 120.3 (C-6′), 38.6 (C-a), 38.3 (C-a′), 55.3 (MeO-5)。

化合物9，3,3′,5-三羟基联苄[17]，无定形粉末；ESI-MSm/z：229.0 [M-H]-,1H NMR (400 MHz, aceton-d6)δH：6.23 (2H, s, H-2, 6), 6.18 (1H, s, H-4), 6.71 (1H, s, H-2′), 6.65 (1H, d,J= 8.4 Hz, H-4′), 7.07 (1H, t,J= 8.4 Hz, H-5′), 6.69 (1H, d,J= 8.4 Hz, H-6′), 2.75 (4H, m, H-a, a′), 8.11 (br, HO-H)。

化合物10，trigonopol B[18]，黄色固物，易溶于丙酮，甲醇；ESI-MSm/z：437.3 [M-H]-；1H NMR (400 MHz, aceton-d6)δH：6.82 (1H, s, H-2), 6.74 (1H, d,J= 8.0 Hz, H-5), 6.69 (1H, d,J= 8.0 Hz, H-6), 2.77(4H, m, H-7, 8), 6.34 (1H, d,J= 2.4 Hz, H-10), 6.20 (1H, d,J= 2.4 Hz, H-12), 2.97 (1H, dd,J= 5.7, 15.6 Hz, H-15α) , 2.63 (1H, dd,J= 8.8, 15.6 Hz, H-15β), 4.03 (1H, m, H-16), 4.57 (1H, d,J= 8.0 Hz, H-17), 7.03 (1H, s, H-19), 6.81 (1H, d,J= 8.4 Hz, H-22), 6.89 (1H, d,J= 8.4 Hz, H-23), 3.81 (3H, s, MeO-24), 3.85 (3H, s, MeO-25)。

化合物11，丁香脂素[19]，白色晶体，易溶于丙酮，甲醇；ESI-MSm/z：417.5 [M-H]-，1H NMR (400 MHz, aceton-d6)δH: 6.68 (4H, s, H-2, 6, 2′, 6′), 4.67 (2H, d,J=1.6 Hz, H-7, 7′), 3.10 (2H, m, H-8, 8′), 4.22 (2H, m, H-9α, 9′α), 3.84 (2H, m, H-9β, 9′β), 3.82 (12H, s, CH3O-3, 5, 3′, 5′), 7.12 (br, HO-H);13C NMR (100 MHz, aceton-d6)δc：133.2 (C-1, 1′), 106.4 (C-2, 6, 2′, 6′), 148.7 (C-3, 5, 3′, 5′), 136.1 (C-4, 4′), 86.8 (C-7, 7′), 55.3 (C-8, 8′), 72.3 (C-9, 9′), 56.5 (CH3O-C)。

化合物12，2,4,7-三羟基-9,10-二氢菲[20]，白色固物，易溶于丙酮，甲醇；ESI-MSm/z：227.5 [M-H]-；1H NMR (400 MHz, aceton-d6)δH：6.40 (1H, d,J= 2.4 Hz, H-1), 6.30 (1H, d,J= 2.4 Hz, H-3), 8.21 (1H, d,J= 9.6 Hz, H-5), 6.70 (2H, m, H-6, 8), 2.64 (4H, m, H-9, 10), 8.41 (br, HO-H), 8.16 (br, HO-H)。

化合物13，loddigesiinol B[21]，无色固体，易溶于丙酮，甲醇，氯仿；1H NMR (600 MHz, aceton-d6)δH: 7.00 (1H, s, H-3), 7.14 (1H, d,J= 7.2 Hz, H-6), 7.48 (1H, t,J= 7.2 Hz, H-7), 7.46 (1H, d,J= 7.2 Hz, H-8), 7.80 (1H, d,J= 9.0 Hz, H-9), 7.78 (1H, d,J= 9.0 Hz, H-10), 3.10 (1H, dd,J= 8.4, 15.6 Hz, H-11α), 3.43 (1H, dd,J= 6.0, 15.6 Hz, H-11β), 4.31 (1H, m, H-12), 4.85 (1H, d,J= 7.3 Hz, H-13), 7.13 (1H, s, H-2′), 6.85 (1H, d,J= 8.4 Hz, H-5′), 6.97 (1H, d,J= 8.4 Hz, H-6′), 4.17 (3H, s, MeO-4), 3.87 (3H, s, MeO-3′)；13C NMR (150 MHz, aceton-d6)δc：110.1 (C-1), 154.3 (C-2), 102.2 (C-3), 155.4 (C-4), 115.2 (C-4a), 120.2 (C-4b), 154.8 (C-5), 117.1 (C-6), 127.6 (C-7), 121.5 (C-8), 134.7 (C-8a), 130.1 (C-9), 121.9 (C-10), 134.7 (C-10a), 32.1 (C-11) , 68.3 (C-12), 83.2 (C-13), 131.2 (C-1′), 111.9 (C-2′), 148.3 (C-3′), 147.6 (C-4′), 115.6 (C-5′), 121.1 (C-6′), 58.5 (MeO-4), 56.3 (MeO-3′)。

化合物14，loddigesiinol I[8]，紫红色固体，易溶于丙酮，甲醇；ESI-MSm/z：525.0 [M-H]-，1H NMR (400 MHz, aceton-d6)δH：6.87 (1H, s, H-3), 9.61, (1H, d,J= 9.6 Hz, H-5), 7.15 (1H, d,J= 9.6 Hz, H-6), 7.16 (1H, s, H-8), 7.39 (1H, d,J= 9.2 Hz, H-9), 7.21 (1H, d,J= 9.2 Hz, H-10), 6.70 (2H, s, H-2′, 6′), 6.90 (1H, s, H-2″), 6.79 (1H, d,J= 8.0 Hz, H-5″), 6.67 (1H, d,J= 8.0 Hz, H-6″), 5.50 (1H, d,J= 6.8 Hz, H-a), 4.86 (1H, d,J= 6.8 Hz, H-a′), 3.78 (6H, s, CH3O-3′, 5′), 3.73 (3H, s, CH3O-3″)。

化合物15，loddigesiinol J[8]，粉色固体，易溶于丙酮，甲醇；ESI-MSm/z：527.3 [M-H]-，1H NMR (400 MHz, aceton-d6)δH：6.48 (1H, s, H-3), 8.23 (1H, d,J= 8.4 Hz, H-5), 6.68 (1H, dd,J= 8.4, 3.2 Hz, H-6), 6.62 (1H, s, H-8), 2.2-2.46 (4H, m, H-9, 10), 6.65 (1H, s, H-2′, 6′), 6.81 (1H, d,J= 3.0 Hz, H-2″), 6.79 (1H, d,J= 8.4 Hz, H-5″), 6.64 (1H, d,J= 8.4 Hz, H-6″), 5.33 (1H, d,J= 6.8 Hz, H-a), 4.51 (1H, d,J= 6.8 Hz, H-a′), 3.79 (6H, s, CH3O-3′, 5′), 3.77 (3H, s, CH3O-3″)。

1.4 生物活性分析方法

化合物的抗氧化活性评价采用DPPH自由基清除实验，实验操作参照文献[22]，测试在96孔板上进行，维生素C用作阳性对照药物。α-葡萄糖苷酶抑制活性评价参照文献[23]报道的方法操作，略有修改，对硝基苯酚-α-葡萄糖苷用作底物，trans-白藜芦醇用作阳性对照药物。抗炎活性评价采用抑制脂多糖(LPS)诱导RAW 264.7细胞产生NO的细胞模型，实验操作参考文献[24]，L-NMMA用作阳性对照药物。

2 结果与讨论

中医临床采用石斛治疗糖尿病及其并发症有悠久的历史。为了探索石斛治疗糖尿病的机制，我们以中医临床最常用的石斛药材环草石斛为研究对象，再次进行了植物化学研究，从中分离得到了15个酚类化合物；采用核磁共振、质谱等波谱技术，以及与文献比对的方法，对所得酚类化合物进行了结构鉴定。分别是，chrysotoxol A(1)[9]、neoechinulin A(2)[10]、3,6,9-三羟基-3,4-二氢蒽-1(2H)-酮(3)[11]、4,4′-二羟基-3,5-二甲氧基联苄(4)[12]、柚皮素(5)[13]、5,4′-二羟基-7,3′,5′-三甲氧基黄烷酮(6)[14]、5,7,4′-三羟基-3′,5′-二甲氧基黄烷酮(7)[15]、batatasin-III(8)[16]、3,3′,5-三羟基联苄(9)[17]、trigonopol B(10)[18]、丁香脂素(11)[19]、2,4,7-三羟基-9,10-二氢菲(12)[20]、loddigesiinol B(13)[21]、loddigesiinol I(14)[8]、 loddigesiinol J(15)[8]。化合物1-15结构见图1。其中化合物1-11为首次分自环草石斛的酚类化合物。

根据现代医学对糖尿病机制的研究结论，我们采用DPPH游离基清除实验，酶学实验，抑制LPS诱导的RAW264.7细胞生成一氧化氮(NO)细胞模型等，对分离得到的15个酚类化合物进行了抗氧化活性、α-葡萄糖苷酶抑制活性、抗炎活性评价。评价结果见表1。

图1 化合物1-15结构Fig.1 Chemical structures of compounds 1-15

Compoundα-glucosidaseDPPHNO139.623.210.92>125>25050.03>12522.843.8494.294.549.35107.5>25026.96>125227.724.97>125>25019.18>125204.921.9931.885.813.110>12560.126.311>12531.31.912119.214.18.61352.8>2509.9145.5>2507.5155.8>25014.6维生素Can.tb29.8n.t白藜芦醇a33.8n.tn.tL-NMMAan.tn.t29.0

a：阳性对照药物；b：n.t表示未进行实验

在所选实验条件下，化合物1-4、6、7、12的生物活性是首次被评价；化合物10、14、15的抗炎活性是首次被评价；化合物9、13的α-葡萄糖苷酶抑制活性是首次被评价。本文首次报道了化合物1、3、12有强于维生素C的抗氧化活性；化合物1、9有相当于白藜芦醇的强α-葡萄糖苷酶抑制活性；化合物1、12、14、15有强抗炎活性。

生物活性评价结果显示，所报道的15个酚类化合物都有较好的抗炎性，据此推测，多酚类物质是石斛抗糖尿病的药效物质之一。