NO浓度对小白菜生长和品质的影响

卢 琪，宋天琦，潘 维，徐茜茹，吴蔡楠，宋必秀，都韶婷

（浙江工商大学环境科学与工程学院，浙江杭州 310018）

随着人们生活水平的提高和工农业的迅速发展，全球氮氧化物排放量大幅增加，大气氮氧化物浓度日益攀升[1]。大气氮氧化物已成为一类典型的污染物[2-3]。He等[4]对北京城郊空气监测发现其氮氧化物浓度高达100～200 nL/L；Zou等[5]在广州城郊监测的氮氧化物浓度为22～76 nL/L；Xiang等[6]在成都郊区监测的氮氧化物浓度为50～119 nL/L。众所周知，大气中的氮氧化物主要由二氧化氮 (NO2) 和一氧化氮 (NO) 组成。NO2的比例较高，且对生物的毒性较大。目前，关于大气氮氧化物环境效应的研究主要集中于与NO2相关的研究[7-9]。而作为氮氧化物主要成分之一的NO，因其广泛参与了植物生长发育的调控过程[10]，以往对它的研究主要着重其信号调控机制，而对大气NO浓度变化的环境生物效应的研究则几乎属于空白。

实际上，NO作为一种广泛参与植物体各种生理活动的重要信号分子，如调控组织器官的发育[11-12]及养分吸收利用[13]等，其在大气中的浓度变化很可能对植物的生长产生较大影响。至今，已有许多研究证明适量提高植物体内NO浓度对植物生长有益，如水培番茄培养液中添加100或300 μmol/L的NO供体能显著增加盐胁迫下番茄的根长与叶片中的叶绿素含量[10]；1 mmol/L NO供体能显著提高黄瓜的耐寒性[14]；NO供体浓度为50 μmol/L能降低镉对水稻的胁迫[15]。然而，用于上述研究的NO均来源于NO的化学试剂型供体 (如硝普钠SNP、二醇二氮烯翁NONOate等)。这些NO供体均作用于植物的根系，且其浓度受其释放动力学及环境条件等多方面因素的影响[16]，因而无法利用化学型供体的研究结果来直接推测不同浓度气态NO对植物的影响。因此，若想了解大气NO浓度变化对植物生长及品质的影响，迫切需要开展以气态NO为供体的研究。此外，本课题组以往研究已证实200 nL/L的NO气体对菠菜的生长具有一定促进作用[17]，具备一定的农业应用前景。但植物对更低浓度或更高浓度NO气体的生长响应特征尚未明确。因此，研究不同浓度NO气体对植物生长的影响，无论是生态还是农业生产角度，均具有十分重要的意义。综上，本文将以常见且典型的蔬菜—小白菜为研究对象，采用密闭体系内土培的种植方式，开展不同NO气施浓度(100、200和400 nL/L) 对其生长、营养及抗氧化品质的影响，以期为污染生态和农业生产提供一定的理论依据。

1 材料和方法

1.1 供试土壤及植物

供试土壤取自浙江杭州近郊区菜园表层土壤(0—40 cm)。土壤pH、电导率、阳离子交换率、铵态氮和硝态氮按鲍士旦[18]的方法测定。土壤基本理化性质如下：pH 7.2、电导率0.70 mS/cm、铵态氮2.50 mg/kg、硝态氮13.4 mg/kg、阳离子交换率7.90 cmol/kg。盆栽作物为小白菜 (Brassica chinensisL., 上海青)。

1.2 盆栽处理

相同大小的小白菜种子经0.1% 过氧化氢表面消毒20 min后，用蒸馏水冲洗，于室温下浸泡过夜。随后，转移至土壤中培养至发芽。幼苗长至双叶龄(大约播种后20 d) 后间苗，保留长势一致的幼苗，每盆4株。随后参考Du等[19]的方法对密闭体系注射经氮气稀释的NO气体，使处理体系内NO终浓度分别为0、100、200和400 nL/L。经测定，注射气体3 h后，NO含量约为初始的80%～90%；12 h后，NO含量约为初始的60%～70%。因此，本试验于每日清晨换气，并更新NO气体。培养期间密闭体系内CO2浓度按于承艳等[20]的方法维持于 (350 ± 30) μL/L左右。培养过程中通过补充去离子水保持土壤含水量于60%左右。移栽约2个月后收获，拍照后称重并测下述指标。

1.3 测定指标及方法

硝酸盐含量的测定参考李合生[21]的方法，即选取小白菜地上部样品加入蒸馏水后沸水加热30 min，取部分提取液与5%水杨酸-浓硫酸 (w/v) 溶液充分混匀。室温放置20 min后，加入NaOH溶液。待冷却至室温后，于410 nm波长下测定吸光度。可溶性糖含量用硫酸-蒽酮比色法测定[22]。可溶性蛋白含量按考马斯亮蓝法测定[23]。总酚含量参考Jin等[24]方法，采用福林酚比色法测定。总黄酮参考Dewanto等[25]的方法用95%乙醇 (v/v) 提取后加入30%乙醇溶液和5%NaNO2溶液。5 min后加入10%Al(NO3)3溶液，静置5 min。随后加入1 mol/L NaOH，充分反应后于510 nm下比色测定。抗坏血酸含量按Gupta和Prakash[26]的方法，用2, 6-二氯苯酚-靛酚钠盐滴定法测定。

1.4 数据统计与分析

本研究所有生理生化指标测定均重复3次。所得数据和图表用Excel和Kyplot软件处理。

2 结果与分析

2.1 不同外源NO浓度对小白菜生物量的影响

如图1所示，外施NO气体显著促进了小白菜地上部的生长。与对照相比，NO处理下的小白菜的生物量明显增加，其中以100 nL/L NO处理下小白菜个体增加最为明显。就数值而言，100、200和400 nL/L NO处理下的小白菜鲜重分别比对照增加了64%、42%和10% (图1)，说明外源气施NO可促施小白菜生物量的提高。但随着NO处理浓度的增加，其促进生长的效果逐渐下降，400 nL/L NO处理下植物的鲜重与对照无显著差异。与鲜重类似，NO气体处理也促进了植物干物质的积累。其中，NO处理浓度为100 nL/L时，小白菜干重增加幅度最高，比对照增加了88%。随着NO处理浓度的增加，虽然NO对干重的促进效果逐渐下降，但与对照相比200和400 nL/L NO处理下小白菜的干重仍然分别增加了61%和49%。因此，外源施加低浓度气体NO (100～400 nL/L) 能够显著提高小白菜的生物量，并以100 nL/L时的促进效果最佳。

2.2 不同外源NO浓度对小白菜营养品质的影响

人体摄入的硝酸盐可被还原为亚硝酸盐，对人体健康构成威胁[27]。由于人体摄入的硝酸盐有72%～94%来自于蔬菜[28]，因而蔬菜中的硝酸盐含量备受关注，并成为蔬菜营养品质的重要指标之一。本研究中，随着外源气体NO处理浓度的增加，小白菜叶片和叶柄中的硝酸盐含量均有大幅度下降。其中，100、200和400 nL/L NO处理下叶片硝酸盐含量分别比对照减少了59%、76%和94%，在叶柄中则分别下降了26%、25%和67% (图2)。上述结果表明，外源NO气体的施加能够显著降低小白菜体内的硝酸盐含量，并在本研究设置的NO处理浓度内呈浓度-剂量效应。

可溶性糖含量与蔬菜的口感及营养直接相关，也是一个重要的品质指标。与对照相比，100、200和400 nL/L NO气体处理的小白菜叶片可溶性糖含量分别是对照的3.1、2.2和2.3倍 (图3A)。外源气体NO也增加了小白菜叶柄中的可溶性糖含量，使其可溶性糖含量提高了210%、170%和120% (图3B)。总体而言，施加100 nL/L NO时其含量的增幅最大。随着处理浓度的提高，NO气体对可溶性糖含量的促进效果逐渐降低。200 nL/L与400 nL/L处理时的效果无显著性差异。上述结果表明，外源施加NO气体有利于小白菜叶片和叶柄中可溶性糖含量的积累，并以100 nL/L时的促进效果最佳。

图 1 不同外源NO气体浓度对小白菜生长的影响Fig. 1 Effects of different exogenous NO gas levels on the growth of pakchoi

图 2 不同外源NO气体浓度对小白菜硝酸盐含量的影响Fig. 2 Effects of different exogenous NO gas levels on the nitrate concentrations of pakchoi

图 3 不同外源NO气体浓度对小白菜可溶性糖含量的影响Fig. 3 Effects of different exogenous NO gas levels on the soluble sugar concentrations of pakchoi

蛋白质含量也是衡量蔬菜营养品质的重要指标。与对照相比，100 nL/L NO气体处理下小白菜叶片中可溶性蛋白含量增加了78%。随着处理浓度的进一步提高，200和400 nL/L NO处理下小白菜叶片中可溶性蛋白含量分别增加了70%和67% (图4A)。以上结果表明，外源NO气体的施加对叶片可溶性蛋白含量均有促进作用，且3个浓度处理对该指标的促进效果无显著差异。NO气体处理对叶柄中的可溶性蛋白含量影响与叶片类似，施加100、200和400 nL/L NO气体分别使其增加了23%、22%和23% (图4B)。与叶柄的数值相比，外源施加NO气体促进叶片可溶性蛋白积累的幅度更大。

2.3 不同外源NO浓度对小白菜抗氧化性品质的影响

蔬菜中的抗氧化物含量也是评价其品质的重要指标。由于总酚含有多羟基结构，能够起到清除自由基的作用[29]，因而其含量是植物抗氧化品质参考标准之一。与对照相比，施加100、200和400 nL/L NO气体使小白菜叶片总酚含量分别增加了8%、26%和19% (图5A)，说明外源NO气体的施加对叶片总酚含量有促进作用。100 nL/L NO处理浓度对小白菜叶柄中总酚含量无明显影响，但当NO浓度增至200 nL/L和400 nL/L时，叶柄中总酚含量显著提高了79%和61% (图5B)。这表明外源NO气体能够促进小白菜叶片和叶柄中总酚含量的积累，并以200 nL/L时的促进效果最佳。

图 4 不同外源NO气体浓度对小白菜可溶性蛋白含量的影响Fig. 4 Effects of different exogenous NO gas levels on the soluble protein concentrations of pakchoi

图 5 不同外源NO气体浓度对小白菜总酚含量的影响Fig. 5 Effects of different exogenous NO gas levels on the total phenol concentrations of pakchoi

总黄酮能够减少自由基形成[30]，也是一个重要的抗氧化品质指标。与对照相比，施加100、200和400 nL/L NO气体使小白菜叶片总黄酮含量分别增加了13%、46%和32% (图6A)，这说明NO气体对叶片中总黄酮含量的促进效果先上升后降低。同时施加100、200和400 nL/L NO气体处理使叶柄中总黄酮含量分别增加了29%、64%和57% (图6B)，其中200和400nL/L的处理效果间无显著差异。这表明外源NO气体能够促进叶片和叶柄中总黄酮的积累，其中施加200 nL/L左右的NO时其含量的增加最为显著。

抗坏血酸又称维生素C，是人体必需的主要维生素之一[31]。与对照相比，施加100、200和400 nL/L NO气体使小白菜叶片抗坏血酸含量分别增加了22%、14%和15% (图7A)。上述结果表明，外源NO气体的施加对叶片抗坏血酸有显著促进作用，但3个浓度处理对叶片抗坏血酸含量的促进效果无显著差异。此外，100、200和400 nL/L NO气体也使叶柄中抗坏血酸含量分别增加了43%、60%和180%(图7B)。这表明，外源施加NO气体有利于小白菜叶片和叶柄中抗坏血酸含量的积累。

3 讨论

与其它化学型NO供体的研究结果类似[32-33]，外源NO气体的施加也会显著改变小白菜的生长。本研究发现气态NO可使小白菜鲜重及干重均有一定程度的增加 (图1)，说明100～400 nL/L的NO浓度有利于植物的生长。考虑到目前大气中NO尚低于本研究设置的浓度[4-6]，因而就植物生理生态角度而言，近几十年内大气NO浓度的持续增加有利于小白菜的生长。就农业生产角度而言，随着近年来蔬菜大棚的普及，外源施加NO气体对增加小白菜生物量具有一定的应用前景。汽车尾气NO的浓度通常为0.5～1.0 × 106nL/L[34]；农用车发动机NO排放量为0.39～0.43 × 106nL/L[35]。由此可见，本研究设置的NO浓度低于发动机的日常排放量。然而，大棚中气施NO的农业行为是否存在潜在的环境风险仍应在今后的研究中进行评估。另一方面，许多基于NO化学试剂型供体的研究曾指出NO的植物生理效应呈多样性，与其浓度直接相关[16]。如供试植物为黄瓜时，适宜的SNP处理浓度为100 μmol/L[36]；而当供试植株为番茄时，SNP的适宜浓度为10 μmol/L[37]。因此，虽然100 nL/L NO对小白菜生长的促进效果较佳 (图1)，但鉴于不同植物品种间不同的生理结构和特性，其它植物气施NO的适宜浓度也可能存在差异。因此，今后可进一步研究外源NO气体的施加对不同植物影响的差异性。

图 6 不同外源NO气体浓度对小白菜总黄酮含量的影响Fig. 6 Effects of different exogenous NO gas levels on the total flavonoids concentrations of pakchoi

图 7 不同外源NO气体浓度对小白菜抗坏血酸含量的影响Fig. 7 Effects of different exogenous NO gas levels on the ascorbate concentrations of pakchoi

本研究中，外源NO气体的施加有效降低了小白菜体内的硝酸盐含量 (图2)。本课题组先前的研究也已证实低浓度NO供体SNP可促进硝酸盐代谢关键限速酶——硝酸还原酶 (nitrate reductase，NR) 的活性[38]。因此，本研究中气施NO处理也可能通过提高NR活性从而减少植物体内硝酸盐的积累。参考SNP处理小白菜NR的研究结果 (SNP处理浓度升至60 μmol/L后抑制NR活性)[38]，而本研究中小白菜体内的硝酸盐含量与NO处理浓度仍呈剂量-效应关系(图2)，说明NO气施浓度400 nL/L可能尚未超出促进NR活性的范围。此外，也有研究指出NO对NR的影响与供氮水平相关[39]，即低氮和高氮条件下NO对植物NR活性的影响呈相反的作用。本研究的供试土壤未经施肥处理，这也可能是400 nL/L NO气施浓度持续降低小白菜体内硝酸盐含量的重要原因。另外，本研究中100 nL/L NO处理也使小白菜可溶性糖与可溶性蛋白含量显著增加 (图3)。这表明气施NO在促进小白菜生长的同时，还提高了小白菜的营养品质，这可能与NO促进碳、氮同化有关[40-41]。此外，本研究中气态NO对小白菜的抗氧化物质均有一定程度的促进 (图4～图7)。就总酚和总黄酮而言，100 nL/L的气态NO对小白菜叶片中的总酚、总黄酮含量的提升效果已达显著水平，随着处理浓度的提高其促进作用先升后降，该变化趋势与化学型NO供体研究类似[42-43]。并以施加200 nL/L的气态NO对小白菜叶片和叶柄的总酚和总黄酮含量提升效果最佳。就抗坏血酸而言，100 nL/L气态NO对叶片抗坏血酸含量的促进效果最佳，而叶柄中的抗坏血酸含量呈浓度-剂量效应 (400 nL/L NO处理效果最佳)。有报道指出，SNP对植物叶片抗坏血酸酶学系统活性的影响表现为先促进 (0～400 μmol/L)后抑制 (400～1000 μmol/L)的趋势，而其在叶柄中则表现为持续被诱导[44]，这可能是叶柄中抗坏血酸含量持续升高的可能原因之一。综合上述3个抗氧化物含量指标，200 nL/L外源NO气体是提高小白菜抗氧化品质的较佳施加浓度。同时，我们也应注意，由于不同植物的生理特性差异，外源NO气体对其它作物体内抗氧化物质积累的程度可能存在一定差异。

4 结论

外源气施0～400 nL/L浓度的NO均能显著促进小白菜的生长并提高其品质。其中，NO气施浓度为100 nL/L时，NO对小白菜生物量、可溶性糖以及可溶性蛋白含量提高效果最佳；而较高浓度的

NO对小白菜硝酸盐的降低和对总酚、总黄酮和抗坏血酸含量的提升效果较佳。因此，可根据不同需求，选择不同施加浓度进行大棚内小白菜的种植，以提高小白菜的产量和食用价值。值得注意的是，本研究仅采用模拟大棚，不能完全代表实际大棚的种植条件，因此建议今后进一步开展大棚试验。