基于网络药理学方法研究枳实薤白桂枝汤治疗冠心病的作用机制＊

赵 阳，郑景辉，徐文华，赵新望，伍燕宏，罗 蔚，朱梓铭

（1. 广西中医药大学研究生学院 南宁 530001；2. 广西中医药大学附属瑞康医院 南宁 530001）

冠心病又称为缺血性心脏病，属于中医的“胸痹”范畴，是最常见的心血管疾病。根据《中国心血管病报告2017》概要[1]，推算出我国冠心病患者约1 100 万，居各类心脏病之首；另根据《2016 年中国卫生和计划生育统计年鉴》[1]，2015 年我国城市居民冠心病死亡率为0.11067%，农村居民冠心病死亡率为0.11091%，较上一年（0.10750%、0.10537%）均有上升。现代医学对于冠心病的治疗，主要有普通药物治疗、介入治疗、外科手术治疗三种方法[2]，但存在一些问题，如药物的耐受性及药物副反应、介入治疗后的冠脉再狭窄等。随着我国冠心病的发病率和死亡率的逐渐上升，以及疾病治疗模式的转变，越来越多的人使用传统中药作为补充与替代疗法。枳实薤白桂枝汤出自于东汉著名医家张仲景的《金匮要略》，有通阳宣痹、泻满降逆的功效，主治胸阳不振、停痰蓄饮上逆、结滞胸中所致胸痛、胸部胀满、心胸或胃脘部痞塞不通感等症状。现代研究表明，枳实薤白桂枝汤具有抗炎、改善循环、抗血小板聚集、抗凝血、降脂、增加耐缺氧能力、保护缺血心肌等作用，尤其是桂枝挥发油对冠状动脉免疫损伤性炎症有显著的拮抗作用[3]。但是当前对枳实薤白桂枝汤治疗冠心病的多成分、多靶点、多通路的作用机制研究尚不系统和全面，故本文通过网络药理学方法，在分子的水平上，从化学成分、靶点和信号传导通路对枳实薤白桂枝汤治疗冠心病的作用机制进行系统研究，为进一步揭示枳实薤白桂枝汤的药理作用机制提供理论基础。

1 研究方法

1.1 枳实薤白桂枝汤化合物的收集与筛选

枳实薤白桂枝汤由瓜蒌、薤白、枳实、厚朴、桂枝5味药组成。通过中药系统药理学数据库和分析平台（traditional Chinese medicine systems pharmacology database and analysis platform，TCMSP）收集这5味中药的化合物，并以口服生物利用度（oral bioavailability，OB）≥30%和类药性（drug likeness，DL）≥0.18 为限定条件筛选出有效化合物。

1.2 枳实薤白桂枝汤作用靶点的预测

将1.1中枳实薤白桂枝汤有效化合物以mol2格式上 传 到 PharmMapper(http://lilab. ecust. edu. cn/pharmmapper/index.php)服务器平台，选择人类蛋白靶点作为药效团映射，并设定返回靶点数为300 进行作用靶点预测。并将预测出的靶点导入STRING10.5 数据库（https://string-db.org）校正为其官方名称并摘录其标准基因名。

1.3 冠心病相关靶点的检索

将“Coronary Artery Disease”作 为 检 索 词 在GeneCards 数据库（https://www.genecards.org/）检索冠心病发病相关靶点。GeneCards 数据库通过Gifts 算法，能够计算靶点与疾病的相关度，选择相关度得分≥30 的靶点进行研究，并摘录相应的靶点的标准基因名。

1.4 枳实薤白桂枝汤对冠心病作用靶点的预测

将1.2 预测的枳实薤白桂枝汤作用靶点与1.3 检索的冠心病相关发病靶点导入VENNY2.1（http://bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/index.html），得到两组靶点的共同靶点，即枳实薤白桂枝汤作用于冠心病的靶点。并且将每个靶点与每个对其有药理作用的化合物相对应，用Cytoscape3.6.1软件进行拓扑学分析并做出化合物-靶点图。

1.5 枳实薤白桂枝汤对冠心病作用靶点的PPI 网络构建

为了获得枳实薤白桂枝汤对冠心病作用靶点之间的联系，将1.4 预测的枳实薤白桂枝汤作用冠心病的靶点上传至STRING10.5 数据库（https://string-db.org），选择研究物种为人类，设置靶点之间最低要求联系分数为0.4，并隐藏不与其他靶点联系的靶点，获得靶点联系网络图。将该图进一步导入Cytoscape3.6.1软件进行拓扑学分析并构建PPI网络。

1.6 枳实薤白桂枝汤对冠心病作用靶点的富集分析和KEGG通路注释分析

把枳实薤白桂枝汤对冠心病作用靶点导入DAVID Bioinformatics Resources 6.8 数 据 库（https://david.ncifcrf.gov/summary.jsp），分别选择生物过程（biological process）、分子功能（molecular function）和细胞成分（cellular component）对枳实薤白桂枝汤作用于冠心病的靶点进行GO 富集分析，选择KEGG 进行靶点基因通路注释分析。并且使用GraphPad Prism 7 软件将GO 富集分析满足PValue ＜0.05 的结果做成可视化条形图；使用Omicshare (http://www.omicshare.com/)将得到的KEGG 靶点基因通路注释分析满足PValue ＜0.05的结果制作成可视化气泡图。

1.7 枳实薤白桂枝汤主要有效化合物与其作用的冠心病靶点分子对接

利用RCSB PDB 数据库（https://www.rcsb.org/）查找枳实薤白桂枝汤作用的冠心病靶点的PDB ID，将mol2 格式的化合物与PDB ID 形式的靶点上传至Systems Dock Web Site 数据库（http://systemsdock.unit.oist.jp/iddp/home/index）进行分子对接，通过所得的Docking Score 值分析对接分子与靶点之间的结合活性。

2 结果

2.1 枳实薤白桂枝汤有效化合物收集结果

根据1.1 中限定的收集与筛选条件，共得到51 个化合物，分别是瓜蒌11个、薤白11个、枳实22个、厚朴2 个、桂枝7 个，其中beta-sitosterol 为桂枝和薤白共同含有，naringenin为枳实和薤白共同含有。各个中药所含的有效化合物见表1。

2.2 枳实薤白桂枝汤作用靶点的预测

根据1.2 中设置的预测条件，PharmMapper Server平台共预测出14 733 个枳实薤白桂枝汤作用靶点，删除重复靶点后，剩余443 个靶点，将这些靶点导入STRING10.5 数据库校正后，获得381 个靶点及对应的标准基因名。

2.3 冠心病发病靶点检索

根据1.3 中设置的检索条件，GeneCards 数据库共检索出5 264 个与冠心病发病相关的靶点，相关度最高的靶点是Apolipoprotein E（114.83 分），相关度最低的靶点是Blood Pressure QTL 类靶点（0.19 分）。相关度得分≥30的靶点共219个。

表1 枳实薤白桂枝汤有效化合物表

2.4 枳实薤白桂枝汤作用冠心病靶点的预测

将2.2、2.3 结果中靶点的基因名导入VENNY2.1软件，共得到了31 个共同靶点，即枳实薤白桂枝汤作用于冠心病的靶点，具体流程见图1。将每个化合物与其作用的靶点相联系，共得到1 186 对相关的联系，通过Cytoscape3.6.1 软件进行拓扑学分析得出作用靶点数排名前8 的化合物依次是：(+)-catechin（27 个）、Prangenin（27 个）、coumaroyltyramine（26 个）、Eriodyctiol（26 个）、taxifolin（26 个）、Vitamin-e（26 个）、poncimarin（26 个）、Hesperetin（26 个），做出化合物-靶点联系图见图2。

2.5 枳实薤白桂枝汤对冠心病作用靶点的PPI网络

根据1.5 中对靶点之间最低要求联系分数为0.4的设定，STRING10.5 数据库获得31 个靶点之间共166条联系的网络图。将图导入Cytoscape3.6.1 软件进行拓扑学分析得出联系其他靶点个数排名前10 的靶点依次是：ALB（27 个）、ACE（21 个）、REN（19 个）、F2（18个）、NOS3（18 个）、MAPK1（18 个）、MMP9（18 个）、MMP2（15 个）、PPARG（15 个）、SELE（15 个），而有3 组靶点之间的联系程度较高，第一组包括的靶点F2、F10、F7、GP1BA、ALB、PLAT，第二组包含的靶点有REN、ACE、NOS3、ESR1、MAPK1、JAK2、NOS2，第三组包含的靶点有MMP1、MMP2、MMP3、MMP9。构建的PPI网络图见图3。

图1 枳实薤白桂枝汤作用冠心病靶点的预测图

图2 枳实薤白桂枝汤有效化合物作用冠心病靶点网络图

2.6 枳实薤白桂枝汤对冠心病作用靶点的GO富集分析和KEGG通路注释分析

根据1.6 中的分析方法，GO 富集分析在生物过程、分子功能、细胞成分三个方面，分别得到76 个条目、26 个条目、14 个条目。生物过程排名前十的条目中，与冠心病相关的包括：response to estrogen、blood coagulation、leukocyte migration、angiotensin maturation；分子功能排名前十的条目中，与冠心病相关的包括：zinc-ion binding、heme binding；细胞成分排名前十的条目中，与冠心病相关的包括：caveola、proteinaceous extracellular matrix，三个方面各选取前10 条条目做成可视化条形图，见图4；KEGG 通路注释分析得到19 条通路，与冠心病相关的包括：Estrogen signaling pathway、PPAR signaling pathway、Complement and coagulation cascades、Renin-angiotensin system、TNF signaling pathway、TGF-beta signaling pathway，可视化气泡图见图5。

图3 枳实薤白桂枝汤对冠心病作用靶点的PPI网络图

2.7 枳实薤白桂枝汤主要有效化合物与其作用的冠心病靶点分子对接结果

图4 枳实薤白桂枝汤对冠心病作用靶点的GO富集分析

根据2.4 中枳实薤白桂枝汤有效化合物拓扑学分析 的 排 名 结 果，选 取(+)-catechin（MOL000492）、Prangenin （MOL013430） 、 coumaroyltyramine（MOL000631）、Eriodyctiol(flavanone)（MOL002914）、taxifolin（MOL004576）这5 个排名前五的化合物作为主要有效化合物与枳实薤白桂枝汤作用的31 个冠心病靶点进行分子对接。一般认为Docking Score 值＞4.25 表示对接分子与靶点之间有一定的结合活性，＞5.0 表明对接分子与靶点之间有较好的结合活性，＞7.0 则说明具有强烈的结合活性。本研究的155 组对接中，Docking Score 值＞8 的有1 组，Docking Score值＞7 的有5 组，Docking Score 值＞6 的 有74 组，Docking Score 值＞5 的有91 组，Docking Score 值＞4.5的有102组，各组分子对接详情见表2和图6。

3 讨论

网络药理学是一种结合系统网络分析和药理学的方法，可以在分子水平上对药物治疗疾病的有效成分、靶点、通路进行系统研究，从而了解成分、靶点、通路之间的相互作用关系。由于中药方剂具有多成分、多靶点、多通路的特征，仅研究单一的成分、靶点或者通路难以全面地了解中药治疗的作用机制，所以网络药理学研究方法为中药研究提供了新的思路和方法。

表2 枳实薤白桂枝汤主要有效化合物与其作用的冠心病靶点分子对接结果

研究结果显示，枳实薤白桂枝汤的51个有效化合物，与其作用的31 个冠心病靶点之间共有1 186 对药理作用，平均每个化合物作用23 个靶点，平均每个靶点能被38个化合物作用，表明在枳实薤白桂枝汤作用于冠心病靶点的过程中，同一个化合物可作用于多个靶点，同一个靶点也可以被多个化合物作用，不同的药物之间，不同的化合物之间，存在着共同作用或协同作用。据研究发现，作用靶点数排名前8 的化合物中，(+)-catechin（儿茶素）能够抑制血管平滑肌细胞的黏附和迁移，抑制血管紧张素Ⅱ刺激血管平滑肌细胞的生长和繁殖[4-5]；coumaroyltyramine（香豆酰基酪胺）能够抑制乙酰胆碱酯酶、细胞增殖、血小板聚集以及抗氧化[6]；taxifolin（紫杉叶素）具有降低餐后血糖的作用，还有抗炎与抗氧化的功能[7]；Vitamin-e（维生素E）被证明可减少糖尿病患者心血管事件的发生，从而降低死亡率[8]；poncimarin（香豆素衍生物）能够通过抑制胆固醇合成的靶点减低血胆固醇，从而降低动脉粥样硬化和冠心病的危险因素[9]；Hesperetin（橙皮素）具有良好的抗血小板聚集和抗凝血作用，对心肌缺血和梗塞治疗效果良好[10]。

图5 枳实薤白桂枝汤对冠心病作用靶点的KEGG通路注释分析

图6 枳实薤白桂枝汤主要有效化合物与其作用的冠心病靶点分子对接结果

在枳实薤白桂枝汤作用冠心病的31个靶点中，有3 组靶点之间的联系程度较高。第一组靶点是F2、F10、F7、GP1BA、ALB、PLAT，其中F2、F10、F7 均属于凝血因子，是冠心病血液凝固堵塞冠脉过程中必不可少的过程；GP1BA 是血小板膜上血管性血友病因子（vWF）受体组成的必须成分，只有通过vWF 与血小板膜上vWF 受体结合，血小板才能黏附在血管壁上起到凝血的作用[11]；ALB 是血清白蛋白，研究表明，正常浓度的血清白蛋白可以抑制血小板的活化和聚集，从而减少冠心病的发病危险[12]；PLAT是组织型纤溶酶原激活物，在血液中起着抗凝的作用。第二组靶点是REN、ACE、NOS3、ESR1、MAPK1、JAK2、NOS2，REN（肾素）与ACE（血管紧张素转化酶）是RAAS系统的重要组成，是生成血管紧张素Ⅱ的必要条件，血管紧张素Ⅱ能促进醛固酮释放，使血管增生、动脉粥样硬化，心脏重构[13]；NOS3与NOS2均为一氧化氮合酶，生成体内的NO，而适当浓度的NO 够抑制血管平滑肌细胞增生、扩张血管、抗低密度脂蛋白氧化、抗血小板聚集、抗白细胞黏附、拮抗血管紧张素Ⅱ[14]；ESR1 为雌激素受体Ⅰ，而雌激素有抗动脉粥样硬化的作用；MAPK1（丝裂原活化蛋白激酶1）与JAK2（Janus 酪氨酸激酶2）是生物体内重要的信号传导通路，在冠脉内皮细胞的炎症性反应、增殖、分化、凋亡等过程中有重要调控作用[15]。第三组靶点是MMP1、MMP2、MMP3、MMP9，这4个靶点均为基质金属蛋白酶（MMP），研究表明，细胞外基质是粥样斑块稳定的重要因素，而MMP能够降解细胞外所有的基质成分，其中MMP2 与MMP9 对冠脉粥样硬化斑块破裂的影响尤为严重[16-17]。分析这3组靶点可以发现，第一组靶点主要与冠心病的凝血机制有关，第二组靶点主要与血管紧张素转化酶抑制、NO 保护、雌激素保护机制有关，第三组靶点主要与冠脉粥样硬化斑块稳定机制有关。这3组联系程度较高的17 个靶点，包含了8 个与其他靶点联系个数排名前十的靶点，故分析这3 组靶点能较好地体现出枳实薤白桂枝汤治疗冠心病的作用机制。

对枳实薤白桂枝汤作用冠心病的31 个靶点进行GO 富集分析，生物过程方面，排名前十的条目中，除了response to estrogen（雌激素反应）、blood coagulation（凝血）、angiotensin maturation（血管紧张素成熟）与冠心病关系较密切之外，leukocyte migration（白细胞迁移）过程使白细胞进入内膜下与血管内皮细胞黏附，从而引起内膜损伤并继发炎症引起冠脉粥样硬化[18]。分子功能方面，排名前十的条目中，zinc ion binding（锌离子结合）功能能使锌离子发挥抗氧化作用，及时清除氧自由基，保护血管内皮不受损伤[19]；heme binding（血红素结合）功能使血液中多余的游离血红素与血红素结合蛋白相结合后清除，防止游离血红素导致氧化应激反应对心血管系统造成损伤并加重炎症反应[20-21]。细胞成分方面，排名前十的条目中，caveola（小窝；小凹）位于细胞膜上，是小凹蛋白-1 表达的场所，而小凹蛋白-1 能表达于炎症细胞，对炎症反应起负调节作用，研究发现，小凹蛋白-1 的低表达与冠脉粥样斑块的形成与不稳定密切相关[22]；proteinaceous extracellular matrix（蛋白质性细胞外基质）则与粥样斑块的稳定性密切相关。通过GO 富集分析，进一步得出枳实薤白桂枝汤治疗冠心病可能与雌激素反应、抗凝、血管紧张素转化酶抑制、抗炎、抗氧化、稳定粥样斑块这6个机制有关。

图7 TNF signaling pathway流程图

6 条KEGG 分析所得的与冠心病关系密切的6 条通路中，除Estrogen signaling pathway（雌激素信号通路）、Complement and coagulation cascades（补体和凝血级联）、Renin-angiotensin system（肾素血管紧张素系统）分别与冠心病雌激素反应、凝血、血管紧张素转化酶抑制关系密切之外，PPAR signaling pathway（过氧化物酶体增殖物激活受体信号通路）中，过氧化物酶体增殖物激活受体通过促进脂肪细胞合成、抑制脂肪细胞分解来调节血脂，从而预防冠脉粥样硬化及血管炎症反应[23-24]；TNF signaling pathway（肿瘤坏死因子信号通路）中，肿瘤坏死因子可以诱导白细胞介素等促炎细胞因子，从而引起炎症反及损伤血管内皮细胞[25]；TGF-beta signaling pathway（转化生长因子信号通路）中，转化生长因子能够抑制TNF-α、IL-1、IL-2 等细胞因子的表达及其作用，从而抑制冠脉炎症反应，且能增加细胞外基质并抑制基质金属酶作用，从而达到稳定斑块的作用[26]。本研究选取TNF signaling pathway阐述其通路机制，见图7，细胞外的TNF 与细胞膜上的受体TNFR1 结合后，信号传递到细胞内，激活MAPK信号通路，MAPK 信号通路是由MAP3K-MAP2KMAPK 三级激酶组成的级联反应，TNF 与膜上受体结合产生的信号依次激活MAP3K、MAP2K、MAPK，最后将信号传达至下游应答分子，从而调控细胞的分化、增殖、凋亡等生理过程[27-28]。图7中细胞内红色五角心表示ERK1/2，是MAPK 信号通路的一种，可以磷酸化一系列蛋白，包括代谢酶、结构蛋白等，从而促进基因的转录与表达以达到调控细胞的作用[29]。如图7 所示，本条研究的通路中，细胞外的TNF 刺激信号通过ERK1/2 传递至细胞核，经过细胞核的转录与表达，引起MMP3、MMP9、SELE 等成分表达的变化。研究表明，MMP3 与MMP9 能够降解细胞外的基质成分，破坏冠脉粥样斑块的稳定性；SELE（选择素E）是由血管内皮细胞胞外部分的酶裂解而来，并在血液中循环，血液中的SELE 能介导白细胞渗出，在血管内皮细胞表面聚集和黏附多种白细胞和T 细胞及其亚型，促发冠脉炎症反应，是动脉粥样硬化形成的重要机制[30]。

本研究应用网络药理学的方法研究枳实薤白桂枝汤治疗冠心病的作用机制，通过对枳实薤白桂枝汤作用冠心病靶点的PPI网络图分析、GO分析、KEGG通路分析，预测出枳实薤白桂枝汤可能通过抗凝血、稳斑块、抗氧化、抗炎症、降血脂、抑制RASS系统、增加NO保护、促进雌激素保护这些机制起到治疗冠心病的作用。并且通过分子对接方法，验证了枳实薤白桂枝汤有效化合物对冠心病相关靶点有较好的结合活性，证明了本研究预测的真实性。下一步，本课题组将通过临床试验进一步验证枳实薤白桂枝汤对冠心病各个靶点、各条通路的作用，以期全面阐释其作用机制。