蠲痹历节清方对痛风细胞模型中PPARγ、TLR4、NF-κB的影响＊

郭玉星，熊 辉，易法银，朱方晓，陆小龙，周 彪，齐新宇，向黎黎，邵先舫

（1. 常德市第一中医医院 常德 415000；2. 湖南省中医药研究院附属医院 长沙 410006；3. 湖南中医药大学 长沙 410208；4. 湖南中医药大学第二附属医院 长沙 410005）

痛风性关节炎为结晶尿酸钠诱导关节及其周围组织发生的急性炎症反应。痛风性关节炎患病率与日俱增，全球成人发病率1%-6%[1]。秋水仙碱、非甾体抗炎药等临床抗痛风化学药物，易于引发肝肾损伤、骨髓抑制等不良反应。痛风属中医学“痹症”、“历节”等范畴，应用四妙丸等古方可安全有效治疗痛风[2]。蠲痹历节清方由苍术、黄柏、黄芩等组成，具清热、利湿、散瘀功效，为临床验方，可显著改善痛风性关节炎症状，降低尿酸，且安全性高[3]。动物试验进一步发现，蠲痹历节清方具有抗炎消肿作用，可减轻关节滑膜组织炎细胞浸润，抑制炎症因子IL-1β、IL-6、TNFα 表达[4-5]，并上调过氧化物酶体增殖物激活受体γ(PPARγ)，下调Toll 样受体4(TLR4)、核转录因子kappa B(NF-κB)[6-8]，提示TLR4/NF-κB 信号通路可能参与了蠲痹历节清方抗痛风炎症效应。本研究在体外痛风细胞模型上，采用药血清药理学方法，进一步验证探究蠲痹历节清方抗痛风炎症作用及其分子机制。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验动物及细胞

健康2月龄SPF级SD雄性大鼠10只（动物合格证号：SCXK＜湘＞2011-0003），体重200-220 g，由湖南中医药大学动物实验中心提供。J774.1小鼠单核巨噬细胞（批号：CBR130812），购于赛齐（上海）生物工程有限公司。

1.1.2 药物

造模药物：尿酸钠盐为北京索莱宝科技有限公司Solarbio 产品（批号U8290），购于长沙凯诺生物科技有限公司。5 mg 尿酸钠盐加45 mL 生理盐水，再加5 mL吐温80，加热搅拌，配成50 mL 尿酸钠溶液，制成浓度100µg·mL-1的尿酸钠溶液。

干预药物：蠲痹历节清方：苍术20 g，黄柏10 g，黄芩10 g，土茯苓15 g，茵陈15 g，防己10 g，泽泻10 g，白术10 g，当归15 g，甘草6 g 等。中药由湖南中医药大学(湖南省中医药研究院）附属医院药剂科进行煎煮、浓缩至原药浓度2.2 g·mL-1，用前加蒸馏水配成所需浓度。

阳性对照药:①盐酸吡格列酮（购于长沙凯诺生物科技有限公司，北京索莱宝科技有限公司Solarbio，批号：A0908AS）用1%梭甲基纤维素钠（CMC-Na）按100 mg·50 mL-1制成混悬液。配制液置4℃冰箱中备用。②SN50（（MerckMillipore，购于上海优宁维生物科技有限公司）:严格无菌条件下，SN50 溶于蒸馏水中，制成20µmoL·L-1浓度的混悬液，-20℃中保存备用。

1.1.3 主要试剂

南美胎牛血清（购于长沙凯诺生物科技有限公司），DMEM（高）（购于长沙凯诺生物科技有限公司），青-链霉素（购于长沙凯诺生物科技有限公司）,细胞蛋白提取RIPA 裂解液（购于上海碧云天生物技术研究所）,TNF-α、IL-6、IL-1β（R&D）酶联免疫分析试剂盒（购于安迪生物科技（上海）有限公司；试剂盒货号分别为DZE20220，DZE20012，DZE20533；批号分别为201511，201511，201511）。 PPARγ，TLR4，NF- κB p65，β-肌动蛋白（β-actin）兔多克隆抗体，鼠抗兔二抗（美国Abcam 公司，批号分别为ab209350，ab13867，ab31482，ab209729，ab73400）。

1.2 方法

1.2.1 药物血清制备

SD 雄性大鼠10 只（200± 20 g，清洁级；湖南中医药大学动物实验中心提供），随机分为蠲痹历节清含药血清组和空白对照血清组，每组5只，按血清药理学常规给药方法：3 天-2 t（time）-1 h（hour）模式，以痛风大鼠动物实验中得出的最有效剂量44 g·kg-1灌胃[9]。空白对照组灌以等剂量生理盐水，每日2 次，连续3天。末次给药1 h 后，用10%水合氯醛按3.5 mL·kg-1量腹腔注射麻醉，经腹主动脉采血。两组均为无菌采血，在室温下放置3 h，血液凝固后3000 rpm·min-1离心15 min，分别收集两组大鼠血清，0.22µm 微孔滤膜过滤除菌，置-20℃冰箱冻存，备用。

1.2.2 细胞培养

将J774.1单核巨噬细胞株[10]于DMEM 高糖培养基（含10%胎牛血清、100 U·mL-1青霉素、100µg·mL-1链霉素）的培养瓶中，置于37℃、5%CO2、100%相对湿度温箱中培养。当细胞生长至约80%-90%汇合时，将细胞进行1∶3传代。

1.2.3 分组与干预

将细胞传代至6孔板，24 h后，按随机法分为6组，即正常对照组（A组）、模型组（B组）、PPARγ激动剂（C组）、NF-κB 阻断剂组（D 组）、空白血清组（E 组）、蠲痹历节清方组（F 组），每组设置5 个复孔。正常对照组培养液中不添加其它成分，模型组培养液中添加终浓度为100µg·mL-1尿酸钠[6]；PPARγ 激动剂组培养液中添 加 终 浓 度 为100 µg·mL-1尿 酸 钠，20 µmol·L-1PPARγ 激动剂吡格列酮；NF-κB 阻断剂组培养液中添加终浓度为100µg·mL-1尿酸钠，20µmol·L-1NF-κB阻断剂SN50；空白血清组培养液中，添加终浓度为100µg·mL-1尿酸钠，10%的大鼠空白血清。蠲痹历节清方组添加终浓度为100µg·mL-1尿酸钠，10%的大鼠蠲痹历节清方含药血清，继续培养48 h。

1.2.4 巨噬细胞中TNF-α、IL-1β、IL-6含量测定

收集每孔细胞上清液，采用酶联免疫法吸附测定（ELISA），严格按照说明书进行。

1.2.5 巨噬细胞中PPARγ、TLR4 基因表达的检测（RT-PCR法）[8]

按照总RNA提取试剂盒说明书提取总RNA，琼脂糖凝胶电泳以及紫外分光光度仪测定RNA的完整性，按Fermentas 逆转录试剂盒说明书进行总RNA 逆转录实验，再以cDNA 为模板，与基因特异性引物，通过PCR 扩增TLR4、PPARγ mRNA。TLR4、PPARγ、actin的 退 火 温 度 分 别 设 为：58℃、55℃、59℃。PPARγmRNA、TLR4mRNA 及β-actin mRNA 的扩增片段分别为189 bp，112 bp，225 bp。将各样本通过凝胶成像和图形分析，得出各条带的光密度值，结果以相对系数= 目的基因（PPARγ、TLR4）mRNA 光密度·βactin mRNA 光密度值，作为目的基因mRNA 的相对表达量。TLR4、PPARγmRNA 所用引物均由上海生工生物工程股份有限公司合成，见表1。

表1 引物序列

1.2.6 巨噬细胞中PPARγ、TLR4 蛋白表达的检测（Western-Blot法）[8]

提取总蛋白，BCA 法测定蛋白质浓度，电泳，转膜，封闭，一抗孵育，二抗孵育，ECL 显色曝光，将图像扫描用凝胶图像分析系统进行信号分析，以β-actin蛋白的光密度值进行标准校正，计算蛋白产物的相对量。

1.2.7 NF-κB核移位情况（免疫荧光法）[10]

细胞分组及处理方法同前，一抗稀释（1∶200），1∶500 稀释TRITC 荧光标记二抗，图像采集在激光共聚焦显微镜下进行。

1.3 统计学处理

数据以均值±标准差（xˉ± s）表示，采用SPSS 16.0软件处理。两组间结果比较，若方差齐时采用LSD法，方差不齐时采用Dunnett T3法进行方差分析，不满足正态性及方差齐性时采用秩和检验。以P ＜0.05为差异显著具有统计学意义。

表2 蠲痹历节清方含药血清干预巨噬细胞活性的量效关系（OD值）

2 结果

2.1 蠲痹历节清方含药血清加入量的选择

采用MTT 法检测不同质量分数的含药血清培养J774.1 巨噬细胞，以各组OD 值来分析。干预前，巨噬细胞OD 值无明显差异（P ＞0.05）；各组巨噬细胞OD值，10%，15%，20%均明显高于5%（P ＜0.01）；含药血清组，10%与15%相比无明显差异（P ＞0.05），但随着含药血清浓度的增加，巨噬细胞OD 值明显降低（P ＜0.01）。因选择含药血清10%作为后续实验的干预浓度，同时空白血清组对应选取10% 的无含药血清。（表2）

2.2 巨噬细胞中TNF-α、IL-1β、IL-6水平比较

与正常对照组比较，模型组巨噬细胞中TNF-α、IL-1β、IL-6 水平显著增高（P ＜0.01），说明尿酸钠可诱导J774.1单核巨噬细胞产生炎性反应。与模型组相比，空白血清组各炎性因子比较无明显差异（P ＞0.05），说明大鼠血清对试验无明显干扰；与模型组比较，NF-κB 阻断剂组、PPARγ 激动剂组、蠲痹历节清方组TNF-α、IL-1β、IL-6 水平均显著降低（P ＜0.01），说明NF-κB 阻断剂SN50、PPARγ 激动剂吡格列酮、蠲痹历节清方均可以抑制尿酸钠诱导巨噬细胞发生的炎症反应。

2.3 蠲痹历节清方对巨噬细胞中PPARγ、TLR4 基因表达的影响

与正常对照组比较，模型组PPARγ mRNA 表达降低（P ＜0.05），TLR4 mRNA 表达显著升高（P ＜0.01）。

表3 各组巨噬细胞中TNF-α、IL-1β、IL-6变化的比较（xˉ± s，pg·mL-1）

图1 各组巨噬细胞中PPARγ、TLR4和β-actin mRNA表达水平

表4 各组巨噬细胞中PPARγ、TLR4mRNA表达的比较（目的基因光密度/内参基因光密度, n = 6）

表4 各组巨噬细胞中PPARγ、TLR4mRNA表达的比较（目的基因光密度/内参基因光密度, n = 6）

注：与正常对照组相比，◆P ＜0.05，◆◆P ＜0.01；与模型组相比，▲P ＜0.05，▲▲P ＜0.01。

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图2 各组巨噬细胞中PPARγ、TLR4和β-actin蛋白表达水平

表5 各组巨噬细胞中PPARγ、TLR4蛋白表达的比较（目的蛋白光密度/内参蛋白光密度，xˉ± s，n=6）

与模型组相比，PPARγ 激动剂组、蠲痹历节清方组PPARγ mRNA 的表达显著升高（P ＜0.01），TLR4 mRNA 的表达显著降低（P ＜0.01）；与模型组比较，NF-κB阻断剂组PPARγ mRNA的表达无明显差异（P ＞0.05），TLR4mRNA有所减少（P ＜0.05）（图1，表4）。

2.4 蠲痹历节清方对巨噬细胞中PPARγ、TLR4 蛋白表达的影响

与正常对照组比较，模型组PPARγ蛋白表达降低（P ＜0.05），TLR4蛋白表达显著升高（P ＜0.01）。与模型组相比，PPARγ 激动剂组、蠲痹历节清方组PPARγ蛋白的表达显著升高（P ＜0.01），TLR4 蛋白的表达显著降低（P ＜0.01）；与模型组比较，NF-κB 阻断剂组PPARγ 的表达无明显差异（P ＞0.05），TLR4 蛋白表达降低（P ＜0.05）。此结果与RT-PCR 检测结果一致。（图2，表5）。

2.5 NF-κB核移位情况

正常培养的J774.1巨噬细胞NF-κB p65主要表达在细胞浆，镜下呈红色荧光，核表达很少，而模型组红色荧光主要表达于细胞核，胞浆表达明显减少[10]。正常对照组中NF-κB p65 主要集中在细胞浆，细胞核中表达较少，模型组及空白血清组中NF-KB p65 主要集中在细胞核中，细胞浆中较少，NF-κB 阻断剂组、PPARγ 激动剂组、蠲痹历节清方组NF-κB p65 主要在细胞浆中，细胞核中相对较少，未出现明显NF-κB 核移位情况，说明NF-κB 阻断剂SN50、蠲痹历节清方、PPARγ 激动剂吡格列酮组均可抑制NF-κB 核移位（图3）。

3 讨论

本研究采用中药血清药理学方法，在体外痛风样巨噬细胞模型上，发现蠲痹历节清方可能部分通过上调巨噬细胞PPARγ 转录与表达，抑制TLR4·NF-κB-1信号通路，最终抑制痛风炎症反应。作为依据，蠲痹历节清方可降低痛风细胞模型中TNF-α、IL-1β、IL-6水平，上调PPAR γ 基因转录与表达，下调TLR4 基因转录与表达，同时抑制NF-κB 核移位。蠲痹历节清方体外抗痛风炎症作用，与PPARγ 激动剂类似，也与蠲痹历节清方前期动物实验结果一致[8]。

图3 各组巨噬细胞中NF-κB核移位情况

急性痛风性关节炎是由尿酸钠结晶脱落进入关节腔，作用于巨噬细胞、滑膜细胞等，释放如IL-1β 等多种炎症介质，进而引起炎症级联反应[11]。本研究采用尿酸钠诱导J744.1单核巨噬细胞炎症反应作为痛风模型，参照Putra[10]等方法建立，模型组巨噬细胞中TNF-α、IL-1β、IL-6 水平较正常对照组显著增高，提示尿酸钠已诱导J744.1单核巨噬细胞发生痛风样急性炎症反应，细胞模型可靠。临床研究发现，TLR4·NFκB-1信号通路密切参与了急性痛风性关节炎发病机制[6]，且PPARγ 激动剂可通过竞争性抑制TLR4·NFκB-1通路，抑制炎症反应[7]。本研究也发现，与正常对照组比较，尿酸钠诱导巨噬细胞PPARγ基因转录与表达显著降低，TLR4 基因转录与表达显著增加，NF-κB核移位，而NF-κB 阻断剂组SN50、PPARγ 激动剂吡格列酮，均可降低巨噬细胞分泌TNF-α、IL-1β、IL-6 的水平，抑制TLR4基因转录与蛋白表达，以及NF-κB 活化核移位，提示，PPARγ 及TLR4·NF-κB 信号通路也参与了本痛风细胞模型。此发现，与Qing[6]等实验结果相似。

本实验制备含药血清采用的灌胃剂量44 g·kg-1是在前期体外大鼠痛风模型中得出的最佳有效剂量[9]，此剂量为8倍临床等效剂量。本研究采用的10%含药血清浓度，是通过MTT 法检测得出最适宜血清浓度，符合血清药理学一般试验方法。本研究中，蠲痹历节清方含药血清，可增加PPARγ 基因转录与表达，降低TLR4 基因转录与表达，阻止NF-κB 核移位，其作用与吡格列酮相似，进一步揭示，蠲痹历节清方，可能部分通过上调巨噬细胞PPARγ 转录与表达，抑制TLR4·NF-κB信号通路，抑制痛风炎症反应。

蠲痹历节清方，是否可通过MyD88(myeloid differentiation factor 88)等其他信号途径尚不明确，蠲痹历节清方分子药理机制-中医方证关联探讨研究及蠲痹历节清方分子药理机制-方药关联研究，在本次实验中也未进行深入探讨，需要在以后研究中加强拓展。

综上所述，本研究进一步发现，蠲痹历节清方可能部分通过上调巨噬细胞PPARγ 转录与表达，抑制TLR4·NF-κB-1信号通路，抑制痛风炎症反应。此发现为蠲痹历节清方临床治疗痛风性关节炎提供了实验科学支持，为中医清热利湿散瘀法治疗痛风性关节炎提供了理论参考依据。