中华鳖白细胞介素21基因cDNA克隆及生物信息学分析

范勇，王兰，张左兵

山西大学 生命科学学院，山西 太原 030006

胃肠道在动物体内拥有巨大的表面积，各种病原体通过肠道进入动物体内可引起肠道免疫系统产生保护性免疫，然而当动物在受到某种外部环境因素的影响后，入侵的病原体可能会破坏肠道免疫稳态，从而导致炎性肠病（inflammatory bowel disease，IBD）的发生[1-2]。IBD 包括克罗恩病（Crohn's disease，CD）和溃疡性结肠炎（ulcerative colitis，UC），它们分别与辅助性 T 细胞（helper T cell，Th）Th1 和 Th2 有关。近年来发现，CD 和 UC的发病机制也和Th17 细胞有重要关系[2-6]。在临床实验中发现CD 患者体内表达高水平的白细胞介素（interleukin，IL）17[7-8]。Th17 细胞可以产生IL-21，并且IL-21 通过自分泌的方式促进Th17 细胞分化[9-10]。全基因组关联研究表明，人IL-2、IL-21 位点多态性与 UC 和 CD 有关[11]。研究表明，与健康人相比，乳糜泻和UC 患者外周血和肠道中IL-21的含量有所增加[12]。通过葡聚糖硫酸钠（dextran sulfate sodium，DSS）诱导建立的IL-21-/-小鼠溃疡性结肠炎模型中，IL-17的表达降低，说明IL-21 对肠道炎症有一定的促进作用[13]。IL-21可通过与肠固有层成纤维细胞和上皮细胞的IL-21 受体（IL-21R）结合，使结肠成纤维细胞诱导基质金属蛋白酶MMP1 和MMP3的分泌，从而导致IBD 中细胞外基质（extracellular matrix，ECM）降解和黏膜组织损伤[10]。

IL-21 是具有4 个α螺旋的Ⅰ型细胞因子家族成员[14]，虽然可由多种CD4+T 细胞产生，但主要是由滤泡辅助性T 细胞（follicular helper T cell，Tfh）和 Th17 细胞产生[15]。中华鳖（Pelodiscus si⁃nensis）在动物分类地位上属于脊椎动物门、脊索动物亚门、爬行纲、无孔亚纲、龟鳖目、曲颈龟亚门、鳖科，具有很高的食用和药用价值，是我国当前最重要的淡水养殖品种之一[16]，广泛分布在我国各地区。但近年来发现在中华鳖养殖过程中会出现大规模死亡现象，且很多个体的主要解剖症状为肠道出血[17]。虽然IL-21 在很多文献中被证明和肠道炎症有关，但有关中华鳖IL-21的信息尚无。因此，克隆中华鳖IL-21基因cDNA 并进行相关生物信息学分析，对于爬行类动物免疫和我国中华鳖疾病防治，尤其是肠道炎症的防治有重要意义。

1 材料与方法

1.1 材料

中华鳖购自河北省玉田县中华鳖良种场，体重500～750 g，于（25±1）℃水中驯化 2 周，期间每日喂食1 次并换水。取样时采用断头处死法，分离脾脏、肝脏、肠道等组织，液氮速冻，-80℃保存备用[18]。

1.2 cDNA第一链及IL-21cDNA的克隆

脾脏、肝脏和肠道组织样品中分别加入1 mL TRIzol（Invitrogen 公司），提取总 RNA[19]，1.5%琼脂糖凝胶电泳检测RNA的质量。用SMARTer RACE cDNA 扩增试剂盒（TaKaRa 公司）合成3'-、5'-RACE-ready cDNA 文库[18]。根据NCBI数据库中人（Homo sapiens）（NM_021803）、原鸡（Gallus gallus）（NM_001024835）IL-21mRNA 序列，并依据共线性关系，在ENSEMBL 数据库中找到中华鳖对应位置的基因组序列，用GENSCAN（http://genes.mit.edu/GENSCAN.html）在线软件进行预测，将预测片段和火鸡（Meleagris gallopavo，XM_003205701） 、爪蟾（Xenopus tropicalis，NM_001127059）IL-21cDNA 序列进行同源序列比对，在保守区域设计中华鳖IL-21cDNA RACE 引物，由上海生工公司合成（表1）,巢式PCR 反应扩增IL-21的3'与5'端片段。PCR 产物经1%琼脂糖凝胶电泳分离检测后，切胶回收相应的目的片段，克隆到 pMD19-T simple 载体（TaKaRa 公司）上，经转化和菌落PCR 验证，筛选阳性克隆送上海生工公司测序，将测序结果进行BLAST 比对并拼接全长，并且进行全长克隆，测序验证后获得cDNA序列[18]。

1.3 生物信息学分析

用BioEdit 7.2.3 软件对中华鳖IL-21cDNA 片段进行拼接和分析，在ENSEMBL 数据库中搜索得到多种脊椎动物共线性关系并做图分析。中华鳖和其他脊椎动物的氨基酸序列多重比对采用ClustalX 1.8 软件结合BoxShade 在线软件完成，进化树构建用MEGA 6.06 软件完成，涉及的其他物种的氨基酸序列均来自GenBank 数据库。采用SOPMA 在线软件预测蛋白质二级结构，同时利用SMART 在线软件预测蛋白三级结构。蛋白3D 结构预测采用同源建模法，用SWISS-MODEL 在线软件完成。

表1 引物序列及用途

2 结果

2.1 中华鳖IL-21基因全长获得及序列分析

通过3'和5'RACE，分别获得了中华鳖IL-21基因的3'和5' cDNA 片段，经全长验证，得到约700 bp的特异性条带（图1）。将片段切胶回收，与pMD19T simple 载体连接，送上海生工公司测序，测序结果和NCBI 数据库进行比对后确定为中华鳖IL-21cDNA 序列。序列分析表明该基因cDNA 长度为874 bp，开放读框（ORF）长408 bp，5'非翻译区（UTR）为 90 bp，3'UTR 为 376 bp，编码产物包含135 个氨基酸残基。利用SMART 数据库对结构域的检测分析显示，IL-21 包含一个信号肽（1～20 位氨基酸残基）和IL-15结构域（8～134位氨基酸残基）（图2）。同时发现人（BBA22643）、原鸡（NP_001020006）和斑马鱼（ABM46913）的IL-21 蛋白也包含一个信号肽，其次原鸡和美国短吻鳄（XP_019349768）中也发现了IL-15 结构域，而在哺乳类和鱼类中未被发现。

2.2 中华鳖IL-21基因结构与共线性关系分析

通过搜索ENSEMBL 数据库中中华鳖的基因组序列，结合克隆得到的中华鳖IL-21基因cDNA序列，获得了该基因的结构示意图。对应的基因全长 5917 bp，包含 5 个外显子、4 个内含子，除了斑马鱼有6 个外显子，其他物种都是5 个外显子。图3为中华鳖和其他几个物种的IL-21基因的基因结构。

图1 中华鳖IL-21cDNA的PCR扩增

图2 中华鳖IL-21的cDNA序列

图3 中华鳖IL-21基因与基因组DNA结构示意图

根据ENSEMBL 数据库获得的基因相对位置信息，绘制了中华鳖及其他进化上具有代表性的脊椎动物的IL-21基因的共线性关系图（图4）。比较发现，中华鳖同与其邻近物种的IL-21基因存在保守的共线性关系，在中华鳖、人、小鼠、原鸡和爪蟾的该基因附近均可发现FGF2和ADAD1等基因；同时与鸟类和两栖类相比，它们的转录方向相反，但与哺乳类、鱼类相比，IL-21基因的编码方向没有变化。

2.3 中华鳖IL-21基因编码的蛋白特征、结构预测及系统进化树构建

ProtParam tool 分析证明，IL-21 相对分子质量为16.49×103，理论等电点7.57，带负电的氨基酸残基有15 个，带正电的氨基酸残基有16 个，不稳定系数为51.67，总平均亲水性为-0.334，脂溶指数为76.69。SOPMA 在线预测结果表明，IL-21的二级结构主要有α螺旋（59.66%）、β折叠（3.45%）、延伸链（7.59%）和不规则卷曲（39.31%）（图5）。

图4 几种脊椎动物IL-21基因的共线性关系图

图5 几种脊椎动物IL-21氨基酸序列对比

如图6所示，中华鳖IL-21 蛋白与原鸡亲缘关系最近，其次是哺乳类。在SWISS-MODEL 网站，以人IL-21 为模型，构建了中华鳖IL-21 蛋白的3D 模型，两者的一致性为37.78%，中华鳖IL-21的 83～134 位残基处多了 3 个α螺旋，23～26 位残基处多了1 个α螺旋（图7）。

图6 脊椎动物IL-21氨基酸序列进化树（邻接法，自举检验1000次）

2.4 中华鳖IL-21的相似性和一致性分析

将中华鳖与所选物种的IL-21 氨基酸序列做相似性和一致性分析，结果见表2。在所选物种中，中华鳖与原鸡的IL-21的相似性（43%）、一致性（61%）最高，其次与人有较高的相似性（35%）和一致性（46%），与河豚的相似性（22%）和一致性（41%）最低。

3 讨论

在人类IBD的主要形式CD 和UC 患者的肠道中，组织损伤性免疫反应是通过免疫细胞和非免疫细胞之间的活跃交叉作用介导的，IL-21 在这个过程中起重要作用[20]。我们以中华鳖为研究对象，采用SMARTer RACE 技术获得IL-21的cDNA序列。该基因cDNA 序列的3'UTR 有2 个不稳定信号（attta），说明该基因mRNA 半衰期短，符合细胞因子的特征[21]。基因共线性分析比较了中华鳖与其他几个物种，发现中华鳖IL-21与其他物种邻近基因存在保守的共线性关系，在中华鳖、人、小鼠、原鸡和爪蟾该基因附近均可发现FGF2和ADAD1等基因；与哺乳类和鱼类相比，IL-21基因的编码方向没有变化，虽然与鸟类和两栖类相比，它们的转录方向相反，但这可能是由于FGF2和ADAD1基因在IL-21两侧的位置颠倒造成的，这一结果提示我们获得的基因可能是中华鳖IL-21。该基因有5 个外显子和4 个内含子，这一特征与人、河豚和原鸡的基因结构一致，只是斑马鱼有6 个外显子和5 个内含子。与此同时通过构建的进化树还发现，中华鳖IL-21 首先与原鸡聚类，其次是哺乳类，这就表明在进化关系上，爬行类的IL-21进化更接近鸟类[22]，这与分子水平上关于中华鳖进化地位的研究一致[23]。通过氨基酸序列分析可知，该序列有信号肽，这与哺乳类、鸟类和鱼类一致。此外，中华鳖IL-21 蛋白有IL-15 结构域，而在哺乳类和鱼类中未发现，其他爬行类和鸟类有IL-15 结构域，这可能也提示中华鳖IL-21 蛋白与鸟类IL-21 蛋白在功能上比较接近。半胱氨酸对于二硫键的形成非常重要[24-25]，氨基酸多重序列比对表明半胱氨酸在哺乳动物、鱼类、爬行类和鸟类IL-21 中非常保守，提示IL-21的功能可能较为保守。采用同源建模法，以人IL-21为模型预测了中华鳖IL-21 蛋白的3D 结构，两者的一致性为37.78%，中华鳖83～134 位氨基酸残基处（螺旋C）多3 个α螺旋，23～26 残基处（螺旋A）多1 个α螺旋，研究表明IL-21 和IL-21Rα之间的相互作用主要由螺旋A 和C 以及IL-21 螺旋C 后的CD 环介导；与γC 受体之间的相互作用主要由螺旋 A 和 D 以及 IL-21 螺旋 C 后的 CD 环介导，中华鳖和人的IL-21 三维结构上的差异提示它们在受体结合能力或功能上可能存在一定程度的差异[26]。而比较人和小鼠的IL-21 蛋白模型，两者的一致性为56%，也说明该蛋白在一级结构上保守性不强，符合细胞因子的特征，由于免疫系统在进化过程中受到的选择压力比较大，进化速率较快，因此不同物种间的细胞因子在序列间相差较大[27]。

图7 中华鳖和人IL-21蛋白3D模型

表2 中华鳖与其他物种IL-21的相似性和一致性分析

综上，我们克隆了中华鳖IL-21基因cDNA 序列，分析了其基因及蛋白结构，发现了它在进化地位上更接近哺乳类和鸟类。这为中华鳖IL-21基因的相关研究奠定了基础，对爬行动物先天性免疫研究和中华鳖疾病防治尤其是肠炎症的治疗有重要意义。