影响多糖含量测定的不同因素的探究

凌红妹 朱雁青

摘 要：本文研究了在多糖测定中，不同影响因子与多糖测定准确度的关系。采用添加不同的单糖，氨基酸以及金属离子，测定其对苯酚硫酸法测定结果的影响。研究结果表明：木糖、 果糖会导致多糖含量测定结果显著升高;选择吸光值在 0.8-1.2 范围内的样品浓度下进行测定，可以显著减小杂多糖测定结果的偏差。待测多糖溶液中含有脯氨酸会导致反应溶液的吸光值升高，而多糖溶液中含有苏氨酸、丙氨酸、赖氨酸、缬氨酸等会导致反应溶液的吸光值降低。铁离子、亚铁离子、镁离子和锌离子均对反应液的吸光值有一定提升作用，使测定结果偏高。考虑到食品中金属离子的含量较低，故可以认为，在食用多糖的含量测定中金属离子的影响较小。本实验对之后各种食品源的样品中多糖测定提供一定的理论基础。

关键词：多糖;单糖;氨基酸;金属离子

中图分类号：TS201.23 文献标识码：A 文章编号：1671-2064（2019）06-0231-03

多糖（Polysaccharide）指由糖苷键结合的糖链，是组成生物高分子家族中的一个成员[1]。多糖是由10个或者10个以上的单糖分子组合而形成的聚合糖高分子碳水化合物，可分为均一性多糖和不均一性多糖（杂多糖）。大自然中天然存在的杂多糖物质通常由两种或两种以上不同种类的单糖组成，且绝大部分都与脂类或蛋白质结合，形成组分、结构复杂，分子量大小不一的糖脂和糖蛋白等。

在关于多糖物质的实验室研究和工业生产过程中，通常要求对其含量进行测定、调整、监控，但是由于自然界中的多糖物质的种类繁多，各种组成单糖的比例以及存在形式亦存在不同，因此，对于不同的原料不能盲目地采取同一种方法处理，根据不同原料特性来采取适当的多糖分析方法十分重要。目前常用的方法是苯酚-硫酸法[2]、蒽酮-硫酸法[2-3]和3、5-二硝基水杨酸法（DNS法）[4]。

近年来，常用的多糖含量测定方法就是苯酚-硫酸法，具有成本低廉、操作简单、耗时较短、效果显著、重复性好等优点，单糖、寡糖和均一多糖的含量都可以选择此法。该方法的标准曲线均是使用葡萄糖作为基准品进行绘制，即假定所要测量原料的多糖为均一性多糖。但实际上，许多中草药和食品中的多糖组成复杂，大部分是杂多糖，即包括两种或两种以上的单糖分子，如岩藻糖、木糖、甘露糖等。不同的单糖的显色能力不同，测定结果也会有差别。杨勇杰等[5]研究发现，不同的单糖标准溶液在相同浓度、相同波长下测得的吸收值相差较大，分别以其作为标准曲线对杂多糖测定的结果有较大的差异。在银耳多糖含量的测定中，对于同一批次的多糖提取液，假如选择显色能力最强的葡萄糖作为基准物，那么得到的数值就会比真实值略低一些;如果选择显色能力最差的岩藻糖作为基准物，那么测量的数值就会大大超出了真实值。因此，对于杂多糖中不同单糖含量对苯酚-硫酸法测定结果的影响，需要进一步研究。中草药中不仅含有丰富的植物多糖，而且还具有相当一部分的蛋白质和游离的氨基酸分子。另外，在整个多糖的获取和测定过程中，由于原料特性、提取方法、操作水平等條件的不同，得到的产物单糖组成也不一样，可能含有一些难以去除的杂质成分，比如蛋白质、色素、无机盐及小分子物质等。汤文杰[6]等在16种常用中草药常规营养成分、常量和微量元素及氨基酸的含量测定中发现，黄芪、猪苓和油菜籽中氨基酸的成分显著高于其他14种中草药，且富含天冬氨酸和谷氨酸;猪苓、熟地黄、绞股蓝中铜和铁的成分明显要多一些，而油菜籽、绞股蓝和白术中锌的成分稍高。经典硫酸-苯酚法测定多糖含量未考虑金属离子和游离氨基酸对测定结果的影响，其测定结果可能存在一定偏差。因此，为了能够进一步提高中草药多糖含量测量的准确性，阐明影响硫酸-苯酚法测定结果准确性的关键影响因子，要求我们对不同氨基酸和金属离子对测量结果的影响进行实验和讨论。

本文系统的研究并比较常用对照品葡萄糖、鼠李糖、半乳糖、果糖、木糖等显色反应后吸收曲线的稳定性，阐明杂多糖多糖组成对其测定结果的影响。定量研究中草药原料中常见游离氨基酸、金属离子对多糖含量测定结果的影响，进一步阐明多糖含量测定的关键影响因子。

1 实验材料与仪器

葡萄糖，果糖，木糖，鼠李糖，半乳糖购买于天津博迪化工股份有限公司，硫酸，苯酚分别购买于广州永大化学试剂有限公司，苏氨酸，脯氨酸，丙氨酸，天冬氨酸，赖氨酸，缬氨酸，异亮氨酸，亮氨酸等购买于上海源聚生物科技有限公司，大豆肽购买于郑州优然化工产品有限公司，氯化铁，氯化亚铁，硫酸锌，硫酸镁，硫酸铜购买于天津大茂化学试剂厂。

电子分析天平（型号：Sartorius BP211D 分析天平，厂家：中科院广州化学研究所），分光光度计（型号：UV-2100紫外可见分光光度计，厂家：尤尼柯（上海）仪器有限公司）。

2 实验方法

2.1 标准曲线的绘制

采用苯酚-硫酸法测定样品中多糖的含量。

标准曲线的绘制：将葡萄糖粉末置于105℃的烘箱中，干燥3h，准确称取干燥至恒重的葡萄糖25mg于洁净干燥的250ml容量瓶，加水至刻度线并摇匀，配成0.1mg/ml的葡萄糖对照品溶液，在4℃冰箱中冷藏保存，备用。分别精密量取0.1mg/ml的葡萄糖对照品溶液0，0.1，0.2，0.4，0.6，0.8，1.0，1.2ml于10ml具塞试管中，依次添加水使其最终体积为2.0ml，各加入6%的苯酚溶液1.0ml，振摇混匀，加入5.0ml浓硫酸，迅速振摇混匀，于室温放置20min后测定490nm处吸光度。以葡萄糖溶液的浓度（μg/ml）为横坐标，吸光度A为纵坐标，绘制标准曲线。

2.2 具有不同单糖组成的多糖含量测定

分别将干燥至恒重的果糖、木糖按照10%、20%、30%的比例取代葡萄糖，准确称取25mg于250ml容量瓶中，加水至刻度线并摇匀，配成0.1mg/ml的杂多糖溶液，并按照苯酚-硫酸法测定吸光值，样品的吸光值应该在标准曲线的范围之内。

2.3 具有不同种类的氨基酸的多糖含量测定

配制不同浓度梯度的氨基酸溶液和60μg/ml的葡萄糖溶液：分别精确称取0.5，1.0，2.5，5.0，10.0，25.0mg氨基酸于250ml容量瓶中，加水定容至刻度线，配制成2μg/ml，4μg/ml，10μg/ml，20μg/ml，40μg/ml，100μg/ml的氨基酸溶液。准确称取葡萄糖15mg于250ml容量瓶中，加水至刻度线并摇匀，配成60μg/ml的葡萄糖溶液。

分别加入1ml的60μg/ml的葡萄糖溶液和1ml氨基酸溶液，混匀之后，加入1ml的6%的苯酚溶液，以及5ml的浓硫酸，震荡混匀，静置20分钟，在490nm的波长下测吸光度值，样品的吸光值应该在标准曲线的范围之内。

2.4 具有不同种类金属离子的多糖含量测定

配制不同浓度的金属离子溶液和60μg/ml的葡萄糖溶液：分别配制10ppm，20ppm，40ppm，60ppm，80ppm的金属离子溶液和60μg/ml的葡萄糖溶液。分别加入1ml的60μg/ml的葡萄糖溶液和1ml金属离子溶液，混匀之后，加入1ml的6%的苯酚，以及5ml的浓硫酸，震荡混匀，静置20分钟，在490nm的波长下测吸光度值，样品的吸光值应该在标准曲线的范围之内。

3 实验结果与讨论

3.1 葡萄糖标准曲线

利用上述方法制作标准曲线。通过对数据进行线性回归分析，得到在多糖测定过程中，浓度-吸光度的回归方程：y=0.015x-0.0284（0-60μg/ml），相关系数R2=0.999，表明方程的拟合度较好。

3.2 不同单糖对多糖测定的影响

0.1F、0.2F和0.3F分别表示用果糖取代10%、20%和30%的葡萄糖，0.1X、0.2X和0.3X分别表示用木糖取代10%、20%和30%的葡萄糖。由图1可见，将不同比例的果糖或者木糖代替葡萄糖，测得的吸光度值均比葡萄糖高。果糖含量不同导致的多糖含量增加值不一样，其中0.2F的吸光值增加量最大，0.1F次之，0.3F再次之，对照组（纯葡萄糖）的吸光值最低，而木糖则表现不同的影响，0.1X的吸光值最大，对照（纯葡萄糖）的吸光值最低，0.2X次之，0.3X再次之，说明随着木糖含量的增加，多糖测定结果趋近于对照组。

3.3 氨基酸按量对多糖含量测定影响

由图2可见，不同氨基酸对硫酸-苯酚法测定多糖含量有明显不同的影响，其中一些氨基酸使测定结果升高，视为提高组，如多糖溶液中含有0.04mg/ml的脯氨酸会导致反应溶液的吸光值显著升高4.18%，导致测定值与实际值相比偏高。而一些氨基酸则使测定结果降低，视为降低组，如多糖溶液中含有0.04mg/ml的苏氨酸、丙氨酸、赖氨酸和缬氨酸等氨基酸会导致反应溶液的吸光值降低22.7%、9.0%、46.3%、19.2%导致测定值与实际值相比偏低。若样品中含有较多游离氨基酸，其测定值的准确性将受到影响，波动程度由氨基酸种类与浓度决定。

3.4 不同金属离子对多糖測定的影响

由图3可见，铁离子、亚铁离子、镁离子和锌离子的存在均对反应液的吸光值有一定提升作用。10mg/ml的铁离子、亚铁离子、锌离子和镁离子分别使反应液的吸光值提高2.42%、4.94%、2.58%和1.57%;而80mg/ml的铁离子、亚铁离子、镁离子和锌离子则可以分别使反应液的吸光值显著提高11.8%、9.6%、6.4%、13.2%。我国地域辽阔，东南部与西北部区域的土壤因为地质情况不同，无机物富集的情况有很大差异，土地中无机盐在改变植物的生长及新陈代谢活动的同时，也在其体内积累、富集，改变其特殊化学物质的正常积累过程。因此，在选择中草药及测量其多糖含量时，应考虑金属离子的影响。但考虑到食品及保健品中金属离子的含量鲜有超过10ppm的，故可以认为，在食用多糖的含量测定中，金属离子的影响较小。

4 结语

杂多糖的单糖组成对杂多糖含量的测定结果有较显著的影响。杂多糖中含有木糖、果糖会导致多糖含量测定结果偏高，其中杂多糖的单糖组成中含有10%木糖或含有10%果糖会导致测定多糖含量测定结果显著偏高21.5%、26.2%。根据杂多糖组成对测定结果影响的规律可知，在测定杂多糖含量时，选择吸光值在0.8-1.2范围内的稀释倍数下进行测定，可以显著减小杂多糖测定结果的偏差。

待测多糖溶液中含有脯氨酸会导致反应溶液的吸光值升高，导致测定值与实际值相比偏高;而多糖溶液中含有苏氨酸、丙氨酸、赖氨酸、缬氨酸等氨基酸会导致反应溶液的吸光值降低，导致测定值与实际值相比偏低。

常见金属离子如铁离子、亚铁离子、镁离子和锌离子等，均对反应液的吸光值有一定提升作用，使测定结果偏高。考虑到食品中金属离子的含量较低，故可以认为，在食用多糖的含量测定中金属离子的影响较小。

参考文献

[1] Lin N，Huang J， Dufresne A. Preparation， properties and applications of polysaccharide nanocrystals in advanced functional nanomaterials： a review[J].NANOSCALE，2012，4（11）：3274-3294.

[2] 张妍，刘太林.苯酚-硫酸法与蒽酮-硫酸法测定麦冬中麦冬多糖含量的比较研究[J].现代食品，2018（18）：95-102.

[3] 林艺华.硫酸蒽酮法测定风柜斗草粗多糖含量[J].福建分析测试，2017，26（06）：52-55.

[4] 蔡凌云.DNS法测定空心莲子草多糖含量研究[J].凯里学院学报，2017，35（06）：58-60.

[5] 杨勇杰，姜瑞芝，陈英红，等.苯酚硫酸法测定杂多糖含量的研究[J].中成药，2005（06）：706-708.

[6] 汤文杰，孔祥峰，杨峰，等.16种中草药的营养价值[J].天然产物研究与开发，2010，22（05）：867-872.