去唾液酸糖蛋白受体介导的新型肝细胞靶向磁共振对比剂的体外实验研究

刘冠宇，刘 屹

（1.辽宁省肿瘤医院医学影像科，辽宁 沈阳 110042；2.中国医科大学附属第一医院医学影像科，辽宁 沈阳 110001）

去唾液酸糖蛋白受体（Asialoglycoprotein receptor，ASGPR）是特异性识别、结合并内吞血液循环中的一些失去末端唾液酸而暴露半乳糖残基（Gal）和N-乙酰半乳糖胺残基（GalNAc）的糖蛋白[1]。ASGPR 大量表达于肝窦状间隙的肝实质细胞表面，平均每个肝细胞上约有500 000 个结合位点[2-5]，在患有各种肝病（包括急性肝炎、慢性肝炎和肝硬化）的患者中肝细胞表面的ASGPR 表达数量及功能会发生改变，依此可以间接评价肝脏功能损伤程度。

超微型超顺磁性氧化铁（Ultrasmall superparamagnetic iron oxide，USPIO）颗粒小、穿透性强，在体内循环时间较长，且具有生物可降解性，在MR 分子影像探针的研究中应用较为广泛，主要产生较强的T2对比效应[6]。聚乙二醇（Polyethylene glycol，PEG）是一种广泛用于增强疏水性药物溶解度的水溶性聚合物，有研究表明经PEG 包被后的氧化铁颗粒水溶性及稳定性极好[7]，还能逃避网状内皮系统的非特异性吞噬[8-9]。人血清白蛋白（Human serum albumin，HSA）是人血清中最丰富的蛋白质，能转运药物、毒素、营养素、激素和代谢物等小疏水分子[10]。MRI 检查安全无辐射、分辨率高、不同扫描序列可以反应组织及病变的多种生物学特性，在肝脏病变的诊断、个性化治疗方案的选择及疗效评价方面具有绝对优势。本研究构建肝细胞特异性摄取的新型磁共振对比剂（Fe-HSA-LA），检测其对肝细胞的靶向性及作为磁共振对比剂的可行性。

1 材料和方法

1.1 主要实验材料和所用细胞系

Fe-HSA-LA（南京东纳生物科技有限公司），PEG-USPIO（北京万德高科技发展有限公司），HSA（Sigma），乳糖酸（阿拉丁试剂，货号L109639-25g），胎牛血清（Gibco 公司），RPMI-1640 培养基（江苏凯基生物技术股份有限公司），0.25%Trypsin-EDTA（江苏凯基生物技术股份有限公司），磷酸盐缓冲溶液（江苏凯基生物技术股份有限公司），普鲁士蓝染色试剂盒（北京索宝来有限公司），Cell Counting Kit-8（CCK-8）试剂盒（日本同仁化学研究所），琼脂糖（Biowest Agarose），4%多聚甲醛（北京索莱宝科技有限公司）。大鼠正常肝细胞（BRL 3A cells）（购自KeyGEN BioTECH），小鼠结肠癌细胞（Colon26 cells）（Kanazawa University School of Medicine，Kanazawa，Japan）。

1.2 实验方法

1.2.1 Fe-HSA-LA 表征分析及T2弛豫率测定

1.2.2 BRL 3A 细胞及Colon26 细胞体外培养

将BRL 3A 细胞接种于补充有10%胎牛血清（FBS；Gibco）的RPMI-1640 培养基中，Colon26 细胞接种于补充有5%磷酸盐缓冲溶液（PBS）的RPMI-1640 培养基中，放入37 ℃、5%CO2、100%湿度的恒温孵箱培养过夜，镜下观察细胞生长状态，更换新培养基，当细胞生长达80%～90%时传代。实验所用细胞传代数在3～9 代之间。

1.2.3 细胞毒性检测

采用CCK-8 试剂盒对Fe-HSA-LA、PEG-USPIO 的细胞毒性进行评价，具体操作如下：BRL 3A细胞、Colon26 细胞分别用0.25%胰蛋白酶消化，离心后重悬进行细胞计数，将细胞浓度调节为1.0×105mL-1，96 孔板中每孔加入0.1 mL 细胞悬液，37℃、5%CO2、100%湿度培养箱中孵育24 h。弃掉各孔培养基，用PBS 洗3 次，分别加入不同浓度的Fe-HSALA、PEG-USPIO（0、6.25 μg Fe/mL、12.5 μg Fe/mL、25 μg Fe/mL、50 μg Fe/mL、100 μg Fe/mL、200 μg Fe/mL），24 h 后弃上清液，加入100 μL 培养基与10 μL CCK-8 的混合液，继续孵育2 h 后测490 nm 处吸光度值（OD 值），计算细胞存活率，公式如下：细胞存活率（%）=（ODsample-ODblank）/（ODcontrol-ODblank）×100%。

1.2.4 普鲁士蓝染色

BRL 3A 细胞、Colon26 细胞分别用0.25%胰蛋白酶消化，离心后重悬细胞计数后，将细胞浓度调整为1.0×105mL-1，6 孔板中每孔加入2 mL 细胞悬液，37℃、5%CO2、100%湿度培养箱中孵育24 h。次日，取出6 孔板，弃掉孔内培养基后，PBS 洗3 遍，分别加入10 μg Fe/mL 及50 μg Fe/mL 浓度的Fe-HSALA、PEG-USPIO 培养基稀释液，37℃、5%CO2、100%湿度培养箱中孵育24 h。首先在倒置显微镜下观察细胞形态。弃上清液，PBS 冲洗3 次，加入4%多聚甲醛固定细胞20 min，进一步用蒸馏水洗涤3 次。加入普鲁士蓝染色液（10%亚铁氰化钾∶10%盐酸=1∶1 混匀）作用30 min，蒸馏水冲洗3 遍后伊红复染5 min，于倒置显微镜下观察并拍照。

1.2.5 标记细胞体外磁共振成像

“共享经济”是以互联网技术为载体，以获得一定的济效益为目的，使大范围内的陌生人与陌生人之间能够实现资源共享，发挥物品最大的使用价值。“共享经济”主要依靠商品的供给者、需求者以及线上的共享经济平台共同实现。而随着互联网技术的不断发展与完善，人们通过线上APP就能进行商业交易和资源共享，这也大大降低了交易成本，“共享经济”的浪潮也由此而来。

将BRL 3A 细胞及Colon26 细胞浓度调整为1.0×105mL-1，37℃、5%CO2、100%湿度培养箱中过夜。次日，弃上清液，PBS 洗3 遍，分别加入0、0.5、3.125、6.25、12.5、25、50 μg Fe/mL 浓度的Fe-HSALA、PEG-USPIO 培养基稀释液孵育24 h。用0.25%胰蛋白酶消化细胞，用1%琼脂糖胶溶液将细胞团重悬于2 mL Eppendorf 管内。为了减低由外磁场不均匀性产生的干扰，以及来自周围空气的易感性伪影，将这些Eppendorf 管嵌入填充有1%琼脂糖凝胶的塑料容器中行T2加权成像序列及T2map 序列扫描。T2加权成像序列参数如下：TR=3 000 ms；TE=85.6 ms；视野（FOV）=21×21 cm2；像素=320×320；层厚=1 mm；激发次数（NEX）=4。T2map 序列参数如下：TR=1 220 ms；TE=9.2～73.3 ms；FOV=21×21 cm2；像素=320×320；层厚=1 mm；NEX=4。将图像传至GE ADW 4.4 工作站，通过GE Functool-T2mapping 软件选取3 个截面画出感兴趣区（ROI=25 mm2），计算出每组样品的T2弛豫时间及弛豫率（R2，单位：s-1·mM-1，R2=1/T2）。通过AAS 法测定细胞内的铁含量。

1.3 统计学分析

所有数据采用GraphPad Prism 7.0 软件进行统计分析。数据中的计量资料以均数±标准差（）表示。采用独立样本t 检验比较标记细胞的结合铁量，采用Pearson 相关分析进行细胞内铁含量与R2之间相关性分析。P＜0.05 为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 Fe-HSA-LA 表征分析及T2弛豫率测定结果

TEM 显示Fe-HSA-LA 及PEG-USPIO 呈大小均匀、分布均匀、较为规则的类圆形（图1）。AAS 法测定Fe-HSA-LA 和PEG-USPIO 的Z-平均水合粒径分别为（53.38±17.07）nm 和（16.57±4.18）nm（图2）。Fe-HSA-LA 和PEG-USPIO 的Zeta 电位分别为（-23.3±9.10）mV 和（2.57±0.83）mV（表1）。Fe-HSALA 和PEG-USPIO 的T2弛豫率分别为168.40 mM-1s-1和416.30 mM-1s-1（图3b，表1）。

表1 Fe-HSA-LA 和PEG-USPIO Z-平均水合粒径、Zeta 电位及T2弛豫率

2.2 体外实验结果

2.2.1 细胞毒性检测结果

当BRL 3A 细胞与浓度低于或等于50 μg Fe/mL的Fe-HSA-LA 孵育24 h 后，细胞存活率均维持在95%水平以上。当BRL 3A 细胞与浓度为200 μg Fe/mL 的Fe-HSA-LA 孵育24 h 后，细胞的存活率为（66.00±5.85）%。

2.2.2 普鲁士蓝染色结果

光镜下大量细胞内可见蓝染颗粒，特别是在Fe-HSA-LA 标记的BRL 3A 细胞中更为显著（图5）。AAS 检测两种纳米铁颗粒分别标记两种细胞的铁含量（图6）。当Fe-HSA-LA 和PEG-USPIO 的孵育浓度为10 μg Fe/mL 时，BRL 3A 细胞中Fe-HSALA 的累积最高，平均铁含量为（173.30±12.51）pg Fe/cell。孵育浓度为50 μg Fe/mL 时，BRL 3A 细胞的平均铁含量（（503.09±26.86）pg Fe/cell）是在孵育浓度为10 μg Fe/mL 时铁含量的近3 倍。

图1 TEM 图像。图1a：PEG-USPIO；图1b：Fe-HSA-LA。Figure 1.TEM image.Figure 1a:PEG-USPIO;Figure 1b:Fe-HSA-LA.

图2 Z-平均水合粒径。图2a：PEG-USPIO；图2b：Fe-HSA-LA。Figure 2.Z-average hydrated particle size.Figure 2a:PEG-USPIO;Figure 2b:Fe-HSA-LA.

图3a PEG-USPIO 及Fe-HSA-LA T2加权图像。图3b PEG-USPIO 及Fe-HSA-LA T2弛豫率。Figure 3a.T2WI of the PEG-USPIO and Fe-HSA-LA.Figure 3b.T2relaxation rate of PEG-USPIO and Fe-HSA-LA.

图4 Fe-HSA-LA 和PEG-USPIO 孵育BRL 3A 细胞24 h 后的细胞存活率。Figure 4.Cell viability after incubation of BRL 3A cells with Fe-HSA-LA and PEG-USPIO for 24 h.

2.2.3 体外磁共振成像结果

图7a 所示为不同浓度Fe-HSA-LA 和PEGUSPIO 标记BRL 3A 细胞和Colon26 细胞的MR T2加权图像，T2WI 信号强度随浓度增加而逐渐降低，在相同孵育浓度条件下，以Fe-HSA-LA 标记的BRL 3A 细胞信号减低较为明显。图7b 所示4 种标记细胞的MRI R2值随浓度增加逐渐增高，当浓度大于或等于3.125 μg Fe/mL 时，以Fe-HSA-LA 标记的BRL 3A 细胞组的R2值变化最显著（P＜0.05）。

图8a 所示为AAS 测定不同浓度的Fe-HSALA 和PEG-USPIO 标记的BRL 3A 细胞及Colon26细胞结合铁量。随着浓度的增加，标记细胞的铁含量增加。当浓度大于或等于3.125 μg Fe/mL 时，Fe-HSALA 标记的BRL 3A 细胞结合铁量最高（P＜0.05）。

图8b 为不同标记细胞的MRI R2值与AAS 测定细胞结合铁量的相关性分析结果，可见MRI R2值与AAS 测定细胞结合铁量具有良好的相关性。相关系数分别为：Fe-HSA-LA 标记的BRL 3A 细胞r=0.968 1，Fe-HSA-LA 标记的Colon26 细胞r=0.994 1，PEG-USPIO 标记的BRL 3A 细胞r=0.961 7，PEGUSPIO 标记的Colon26 细胞r=0.996 4。

3 讨论

本实验采用表面修饰有PEG 的USPIO 作为靶向探针的信号组件（PEG-USPIO），并将PEG-USPIO与HSA 及乳糖酸偶联，以肝细胞膜上的ASGPR 作为标靶，构建新型肝细胞靶向磁共振对比剂Fe-HSA-LA。PEG-USPIO 在偶联HSA 及乳糖酸后，颗粒水合粒径增加，但从TEM 图中可见偶联前后的粒径未见明显改变，因激光粒度仪测得的粒径为水合粒径，是包括PEG 等包被物厚度的实际纳米颗粒体积，而TEM 只能观察到信号组件氧化铁纳米颗粒的大小、形态，其包被物的厚度是观测不到的[7]。

图5 Fe-HSA-LA 及PEG-USPIO 标记BRL 3A 细胞及Colon26 细胞的普鲁士蓝染色结果。Figure 5.Determination of iron content in Fe-HSA-LA and PEG-USPIO labeled BRL 3A cells and Colon26 cells by AAS.

图6 AAS 测定Fe-HSA-LA 和PEG-USPIO 标记BRL 3A 细胞和Colon26 细胞内铁含量。Figure 6.Fe-HSA-LA and PEG-USPIO labeled BRL 3A cells and Colon26 cells AAS were assayed for cellular iron content after prussian blue staining.

弛豫率是可以衡量纳米铁颗粒磁学性能的指标，T2弛豫率高，表明其对比效果好[11]。本实验结果表明PEG-USPIO 的弛豫率较Fe-HSA-LA 的弛豫率高，即在铁浓度相同时，PEG-USPIO 较Fe-HSALA 的T2信号降低更明显。分析原因可能是因为PEG-USPIO 经与HSA 及乳糖酸偶联后，其表面电位发生了变化。Zeta 电位与胶体分散稳定性相关，随着Zeta 电位增高，体系稳定性越好[12]。本实验结果显示，Fe-HSA-LA 和PEG-USPIO 纳米铁颗粒的Zeta电位分别为（-23.3±9.10）mV 和（2.57±0.83）mV，偶联后的纳米铁颗粒体系稳定性较好，同时偶联前后两种纳米铁颗粒的表面电荷发生了改变，由PEG-USPIO 表面带正电荷转变为Fe-HSA-LA 表面带负电荷。另有研究表明，与磁颗粒尺寸的变化相比，偶联包被物厚度对弛豫率的影响更大，弛豫率随着偶联包被物厚度计算在内的总粒径增加而降低[13]。尽管如此，Fe-HSA-LA（168.4 mM-1s-1）和PEG-USPIO（461.3 mM-1s-1）的弛豫率都可以满足磁共振成像的要求[14]。

图7a Fe-HSA-LA 和PEG-USPIO 标记BRL 3A 细胞和Colon26 细胞的MR T2加权图。图7b 标记细胞的MRI R2值在不同浓度的Fe-HSA-LA 和PEG-USPIO 中的变化曲线。Figure 7a.T2WI of Fe-HSA-LA and PEG-USPIO labeled BRL 3A cells and Colon26 cells.Figure 7b.The MRI R2values of the labeled cells under different concentrations of Fe-HSA-LA and PEG-USPIO.

图8a Fe-HSA-LA 和PEG-USPIO 标记BRL 3A 细胞及Colon26 细胞结合铁量。图8b 4 种标记细胞的MRI R2值与AAS 测定细胞结合铁量的相关性分析。Figure 8a.Fe-HSA-LA and PEG-USPIO labeled BRL 3A cells and Colon26 cells bind iron.Figure 8b.Correlation analysis between MRI R2values of four labeled cells and AAS determination of cell bound iron content.

纳米颗粒的潜在毒性是决定其能否在临床成像中应用的主要因素，也是合成新型对比剂需要密切关注的问题[15]。因此，我们将浓度为6.25～200 μg Fe/mL 的Fe-HSA-LA 和PEG-USPIO 分 别与BRL 3A细胞和Colon26 细胞孵育24 h，细胞毒性检测结果显示，在Fe-HSA-LA 浓度小于或等于50 μg Fe/mL时，细胞存活率达到95%以上，提示Fe-HSA-LA 可作为MRI 对比剂应用于体外研究。普鲁士蓝染色结果提示，BRL 3A 细胞内可见较多蓝染颗粒，表明BRL 3A 细胞对Fe-HSA-LA 具有较高的摄取水平，进一步证实BRL 3A 细胞对Fe-HSA-LA 的摄取主要依赖于ASGPR。

Fe-HSA-LA 标记的BRL 3A 细胞表现出的MR T2WI 信号减低最为明显，AAS 测定相应标记细胞结合铁量结果同样表明随着两种纳米铁颗粒孵育浓度增加，Fe-HSA-LA 标记的BRL 3A 细胞的铁含量增加最显著；当浓度大于或等于3.125 μg Fe/mL时，BRL 3A 细胞对Fe-HSA-LA 的结合能力高于Colon26 细胞，差异具有统计学意义。不同标记细胞的MRI R2值与AAS 测定细胞结合铁量具有良好的相关性，相关系数均在0.95 以上。

综上所述，BRL 3A 细胞结合Fe-HSA-LA 主要归因于细胞膜上的ASGPR 对其的特异性识别内吞，Fe-HSA-LA 可以作为肝细胞靶向磁共振对比剂。对于受体靶向对比剂的合成还有优化和改进的空间。未在亚细胞结构水平进一步确定Fe-HSA-LA细胞内的分布为本研究的局限性之一，合成的Fe-HSA-LA 在体内肝的靶向能力有待进一步验证。