犬利什曼原虫病例报告

单 敏 ， 安 娜 ， 刘宏锋 ， 张伟伟 ， 刘 欣

(1.联宠国际检测中心 ， 北京 海淀 100089 ； 2.美联众合动物医院转诊中心 ， 北京 朝阳 100012)

利什曼原虫(Leishmaniaspp.)属于锥体虫科利什曼虫属的原虫，该原虫会引起人及多种动物利什曼病，是一种重要的人兽共患病。利什曼原虫主要感染对象包括蹄兔目、啮齿目、犬科和人类。该病发展缓慢，具有一定的潜伏期，临床表现为不规则发热，肝脾肿大，渐进性贫血和血浆球蛋白升高等。利什曼原虫的生活史包括前鞭毛体和无鞭毛体2个时期。前者寄生于节肢动物(白蛉或罗蛉)的消化道内，后者寄生于哺乳动物的巨噬细胞内，通过白蛉叮咬传播。目前全世界有88个国家报告过利什曼原虫症的病例，威胁健康人数达3.5亿[1]。我国关于利什曼原虫感染的病例报道较少，本文就2例犬利什曼原虫感染病例介绍如下。

1 病例情况

1.1 病例1 雄性泰迪犬，2岁。注射狂犬疫苗后，出现脱毛，厌食,身体消瘦，发热等临床症状。右侧肩胛部大片脱毛，被覆大量白色结痂，四肢及眼周存在少量结痂，皮肤与黏膜结合处轻微破溃结痂。

1.2 病例2 雌性杂种犬，1岁。最初表现为打喷嚏，2周后出现鼻出血，发热症状，后又出现便血症状。体格检查发现下颌淋巴结及腘淋巴结肿大。

2 实验室检验

2.1 血常规及血液生化检测 病例1及病例2均显示动物存在贫血(见表1)，血液生化结果显示，两例患犬球蛋白水平显著升高(见表2)。

2.3 显微镜观察 对病例1体表结节及病例2淋巴结进行细胞学检查，均可见巨噬细胞内存在大量的利什曼原虫无鞭毛体结构(见中插彩版图1及图2)。

图1 病例1体表结节细胞学检查(Diff-Quik染色，1 000×)

图2 病例2淋巴结细胞学检查(Diff-Quik染色，1 000×)

表1 血常规检测结果

表2 生化检测结果

2.4 PCR检测和分型

2.4.1 目的基因PCR扩增 将病例1的皮肤刮取物、淋巴组织和病例2的血液样本送至联宠国际检测中心进行PCR鉴定。联宠国际检测中心对临床收集的病例1和病例2样本分别提取基因组DNA，随后用利什曼原虫的18S rDNA特异性引物进行PCR扩增，将样品PCR产物进行凝胶电泳，电泳条带大小为602 bp(见图3和图4)，与预期扩增片段大小相符，证实为利什曼原虫。

图3 病例1 18S rDNA基因PCR鉴定
M： DNA分子量标准 ； 1： 病例1 ； N： 阴性对照

2.4.2 序列测定和分型 为进一步对利什曼原虫分型，将用18S rDNA引物扩增的目的产物进行测序，测序由北京六合华大基因科技股份有限公司完成。将测序结果进行Blast序列比对，比对结果与杜氏、婴儿和恰氏利什曼原虫的同源性为100%，再次表明该病例为利什曼原虫病。为进一步确诊利什曼原虫的分型，用LGITSF2/LGITSR2引物进行PCR扩增[2]，PCR产物经琼脂糖凝胶电泳，结果显示，获得约400 bp的特异性片段(见图5和图6)，与预期扩增的片段大小(372～450 bp)相符。之后将获得的PCR扩增产物测序，将测序结果进行比对，用于区分杜氏和婴儿/恰氏利什曼原虫两种亚型(见图7)。经比对表明病例1和病例2均为婴儿/恰氏利什曼原虫感染。

图4 病例2 18S rDNA基因PCR鉴定
M：DNA分子量标准 ； 2：病例2 ； N：阴性对照

图5 病例1 LGITS基因PCR扩增产物的鉴定
M： DNA分子量标准 ； 1： 病例1 ； N： 阴性对照

图6 病例2 LGITS基因PCR扩增产物的鉴定
M：DNA分子量标准 ； 2：病例2 ； N：阴性对照

图7 基因片段序列1801269064-A：病例1LGITS基因片段序列 ；1803089981-B：病例2LGITS基因片段序列

3 治疗

根据临床症状和实验室检测确，诊该两犬患有利什曼原虫病后，采用别嘌呤醇(10～20 mg/kg·bw，每天2次，口服，连用6-18个月)和米替福新(2 mg/kg·bw，每天1次，与食物同时口服，连用4周)进行治疗。

4 治疗结果

经过治疗后，病例1和病例2临床症状均有缓解，血常规检测各项结果均在正常参考范围内，血液生化检测结果显示，球蛋白水平高于正常水平(表3)。

表3 生化检测结果

5 讨论

在我国人群中主要流行杜氏利什曼原虫，杜氏利什曼原虫是黑热病的病原。犬源型的病原为婴儿利什曼原虫，且犬的感染率高，人的感染大都来自病犬，散在发生[3]。1990年WHO利什曼病专家委员会将杜氏利什曼原虫、婴儿利什曼原虫和恰氏利什曼原虫三者视为杜氏利什曼原虫复合体[4]。现许多学者将婴儿利什曼原虫和恰氏利什曼原虫视为同一型[3]。

利什曼原虫的感染机制复杂，所致临床症状存在较大差异[5]。犬感染利什曼原虫潜伏期可长达6周-7年，早期逐渐发病，症状不典型，主要以发热、脾脏、淋巴结病变为主[6]。虫体侵入机体后主要引起多脏器感染，并引起消瘦、食欲不振、沉郁、咳嗽等临床症状，皮肤病变特征为过度角质化、增厚、皮屑以及皮肤、黏膜的溃疡。

经检测病例1和病例2出现血细胞减少和血浆球蛋白升高等症状，初步符合利什曼原虫病临床症状。针对利什曼原虫的检测最早主要是基于细胞学检查，观察到原虫就即可确诊[3]。经显微镜观察，在病例1和病例2的巨噬细胞内均存在大量的利什曼原虫无鞭毛体。但当宿主体内虫体量较低时细胞学检查可能出现假阴性结果。

在利什曼原虫检测方法中，PCR技术具有较高的灵敏性和特异性[7]。已有研究表明，PCR法可对血液中的利什曼原虫特异DNA片段进行高效扩增检测，具有病原学诊断的意义，且能通过片段序列比对分析致病虫种[8]。本病例中，用LGITSF2/LGITSR2引物进行PCR扩增并测序，2只患犬的测序结果与婴儿利什曼原虫病的同源性为100%。

犬利什曼原虫病的主要感染源来自于病犬，无论是感染利什曼原虫的犬还是人类，较长的潜伏期及不明显的临床症状，都使临床上出现较多的误诊的情况。PCR法检测方法具有较高的敏感性和特异性，能高效地发现无症状犬或感染犬，有助于较好的指导犬利什曼原虫病的预防控制工作。