水牛奶干酪功能活性肽的研究

王钰潭，侯坤辉，王雪峰，赵存朝，黄艾祥

（云南农业大学食品科学技术学院，昆明 650201）

我国西南部地区拥有丰富的水牛奶资源，水牛奶乳汁浓郁，味道醇香甜美，乳脂肪、乳蛋白、乳糖、常量矿物元素和维生素等营养成分要优于其他奶源，是老少皆宜、不可多得的营养佳品[1,2]。乳制品中蛋白肽的开发研究是当前热门研究课题，极具发展前景，其相关的研究对于后期投入生产有着重大的基础作用与指导作用[3～5]。贯筋藤（Dregea sinensis hemsL）为萝藦科南山藤属植物，攀援木、质藤本，俗称“奶浆藤”，分布在我国云南大理、丽江地区及陕西、四川、贵州、甘肃等地[6]。贯筋藤蛋白酶是以贯筋藤为原材料提取而制成的一种天然植物凝乳剂，研究表明，其酶活性高、稳定性好，是一种新型优良的凝乳剂[7,8]。本试验在现有研究的基础上，优化了加工工艺，对比了不同凝乳剂添加和市场两种水牛奶奶酪产品的奶酪蛋白肽各项指标的活性差异，以期为以后开展水牛奶奶酪乳蛋白肽的研究提供数据基础和理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料

水牛奶：德宏州芒市畜牧站水牛奶牛合作社提供；发酵剂：FVV-221冷冻直投式干燥发酵剂，荷兰皇家帝斯曼公司产品；凝乳剂：贯筋藤蛋白酶（GJTR，由本实验室提取），商业木瓜蛋白酶（食品级）；对照组：两种市售的水牛奶干酪（市售A和市售B）。

1.2 方法

1.2.1 水牛奶奶酪工艺流程

水牛奶→均质→巴氏杀菌→接种发酵剂→加入凝乳酶搅拌→凝乳切割→排乳清堆酿→热烫拉伸→成品。

1.2.2 蛋白肽提取工艺设计

干酪样品切碎→称取碎块→根据设定好的料液比加入蒸馏水→均质分离→高速冷冻离心→取上清液→超滤→冷冻干燥→干酪蛋白肽。

1.2.3 蛋白肽提取单因素试验

以干酪上清液肽得率为活性肽提取单因素指标，对料液质量比（1∶5、1∶10、1∶15、1∶20、1∶25、1∶30）、匀浆时间（2、4、6、8和10min）、转速（9、11、13、15和17×1000r/min）三个因素做单因素试验，研究各因素变量对干酪上清液肽得率的影响，每组3个重复。

1.2.4 肽得率的测定

多肽含量测定参考文献方法[9,10]，略作修改。取2.5mL样品溶液，加入2.5mL10%的三氯乙酸(TCA)水溶液混匀，静置20min，然后在3 500r/min、4℃离心10min。取1.0mL上述溶液，加入双缩脲试剂3.0mL混匀，60℃水浴显色5min，2 000r/min、4℃离心10min[11]。取上清液于310nm处测定OD值，以谷胱甘肽（GSH）作为标准品，参考样品中多肽测定绘制标准曲线[12]，回归方程为∶y=4.4062x-0.1449,R2=0.9978。1.2.5 二次通用旋转实验设计

在单因素试验的基础上，选择料液质量比、匀浆时间、转速3个因素，采用二次通用旋转试验设计，进行3因素5水平试验，各因素水平见表1。

表1 二次通用旋转因素水平表

1.2.6 超滤操作步骤

根据陈东平[13,14]等报道，分子量越小的肽其自由基清除作用越强、活性越高，本文设置了针对5k以下酪蛋白肽的提取与检测，操作步骤如1.2.2。

1.2.7 蛋白肽的活性测定

1.2.7.1 抗氧化活性测定

（1）总抗氧化能力测定（TEAC）

根据文献方法测定ABTS自由基清除能力[15,16]。吸取分子量5k以下的水牛奶干酪蛋白肽溶液500µL，加入734nm处吸光度为0.7～0.8的ABTS·+稀释工作液3.8mL，室温下反应6min，于734nm处测定吸光值。总抗氧化能力用ABTS自由基清除率表示，公式如下[17]∶

ABTS·自由基清除率（%）=[(s-sb)/(c-cb)]×100%

式中：s为ABTS·自由基清除能力吸光度；sb为样品干扰试验吸光度；c为ABTS·工作液吸光度；cb为蒸馏水吸光度。

（2）还原能力测定（RP）

吸取分子量5k以下的水牛奶干酪蛋白肽溶液，加入pH6.6的0.2mol/L的PBS2.5mL，加入1%铁氰化钾溶液2.5mL，50℃反应20min，加入10%TCA溶液2.5mL，4℃、5 000×g离心10min；吸取上清1mL，加入2.5mL蒸馏水和0.5mL1%FeCl3溶液，于700nm处测定吸光度。以谷胱甘肽为标准样品绘制标准曲线，回归方程为：

式中：y为吸光度，x为谷胱甘肽浓度。

（3）DPPH自由基清除能力测定（DPPH）

①DPPH自由基清除率化学法：

吸取分子量5k以下的水牛奶干酪蛋白肽溶液200µL，加入1.8g/mL的DPPH乙醇溶液2mL，充分振摇后，室温下暗处反应20min，于517nm处测定吸光值。DPPH自由基清除率采用如下公式计算∶

DPPH·清除率（%）=[(s-sb)/(c-cb)]×100%

式中：s为DPPH·自由基清除能力吸光度；sb为样品干扰试验吸光度；c为DPPH甲醇溶液吸光度；cb为蒸馏水吸光度。

②DPPH薄层色谱-生物自显影技术：

根据文献方法[18]，称取DPPH粉末96.70mg，加甲醇溶解并稀释至刻度、摇匀，置于250mL棕色瓶，将DPPH溶液均匀地喷洒在薄层色谱硅胶G中，从左到右依次为蒸馏水空白组、抗坏血酸标准组、实验组。

1.2.7.2 抑菌活性测定

参照文献[15,19]的方法测定抑菌率。取对数期细菌，以含有50mol/mL的NaCl和pH7.4的PBS水洗3遍后，用新鲜Luria-Bertani培养基重悬为1×105CFU/mL的菌悬液。将100µL（5、10、15、20、25mg/mL）GMP及P-GMP加入96孔酶标板中，再加入等体积的菌悬液作为试验组；以100µL含有NaCl的PBS代替等体积水牛奶乳蛋白肽为对照组。在37℃培养12h后，用酶标仪测定600nm波长处的OD值[20]。按如下公式计算酶解液的抑菌率：

抑菌率（%）=[(A对照组-A试验组)/A对照组]×100%

2 结果与分析

2.1 蛋白肽提取工艺

2.1.1 单因素试验分析

（1）最优料液比的确定

图1 料液比对多肽含量的影响

固定转速为11×1000r/min，匀浆时间为2min，考察料液比对肽得率的影响。由图1可以看出，随着料液比的变化，肽得率出现先上升后下降的趋势，在料液比为25g/mL时肽得率最高。

（2）最优匀浆时间的确定

图2 勺浆时间对多肽含量的影响

固定转速为11×1000r/min，料液比为1∶25，考察匀浆时间对肽得率的影响。由图2可以看出，随着勺浆时间的变化，肽得率出现先上升后下降的趋势，在勺浆时间为6min时肽得率最高。

（3）最优匀浆转速的确定

图3 转速对多肽含量的影响

固定匀浆时间为6min，料液比为1∶25，考察转速对肽得率的影响。由图3可以看出，随着转速的变化肽得率出现明显的波动趋势。当转速过低时，上清液中的肽分子无法被充分破碎出来，随着转速的增加，料液与转子之间的摩擦加大，料液受到的剪切力也增大，当转速过快时，料液与转子接触的时间减少，故肽得率降低。因此转速选择11×1000r/min时最佳。

2.1.2 数学模型的建立与检测

二次通用旋转试验方案及结果见表2。利用DPS软件对试验结果进行分析，得到二次回归模型为：

表2 二次通用旋转试验方案及结果

根据试验结果进行方差分析（见表3）。由表3可知，该回归模型达到显著水平（P＜0.05），说明方程与实际情况拟合良好，能够反映肽得率提取效果与液料比、匀浆时间和匀浆转速的关系。

2.1.3 变量轮换直接寻优

根据已建立的数学模型，在-1.682≤Xi≤1.682（i=1，2，3）范围内，每个因素取5个水平（±1.682，±1，0），对53=125个方案进行统计寻优，在试验范围内可得肽得率的最高值为0.54，此时各因素取值为：X1=0，X2=-1.682，X3=0，对应着液料比25∶1，匀浆时间2.64min，匀浆转速11×1000r/min。

2.1.4 频率分析及统计寻优

对不同设计水平下的组合进行模拟试验，以均值0.4765为临界值，获得大于临界值的方案50个，各变量取值的频率分布见表4。由表4可以看出，在95%的置信区间肽得率大于0.4765的优化方案为：料液比为26.61～28.40，匀浆时间为5.11～6.88，转速为10.42～11.58。为了贴近实际的工业化生产，可将优化方案定为：料液比为26∶1，匀浆时间为5min，转速为10×1000r/min。

表3 回归方程方差分析表

表4 优化提取方案中Xi取值频率分布表

2.2 水牛奶干酪蛋白肽的功能活性

2.2.1 抗氧化活性

（1）总抗氧化能力（TEAC）

由图4可知，随着水牛奶干酪蛋白肽浓度的提高，ABTS自由基清除活性均有增强。木瓜蛋白酶组的ABTS自由基清除活性最强，10mg/mL时ABTS清除活性为85.63%；贯筋藤酶组的干酪蛋白肽浓度为10mg/mL时ABTS清除活性为82.22%；两种市售干酪在蛋白肽浓度为10mg/mL时ABTS清除活性分别为84.55%和83.79%。

图4 5K以下蛋白肽ABTS自由基清除率

（2）还原能力（RP）

图5 5K以下蛋白肽还原能力

由图5可以看出，市售A组的干酪蛋白肽还原能力明显高于其他实验组，其余三组之间差异不大。市售A组在浓度为10mg/mL时还原能力为69.43%；贯筋藤酶组的干酪蛋白肽浓度为10mg/mL时还原能力为52.96%，其差异或许与其生产工艺不同有关。

（3）自由基清除能力（DPPH）

图6 5K以下蛋白肽DPPH自由基清除率

由图6可以看出，市售A组的干酪蛋白肽DPPH自由基清除活性稍高于其他实验组，其余三组之间差距不大；市售A组的干酪蛋白肽浓度在10mg/mL时其DPPH自由基清除能力达到62.64%，贯筋藤组相对较低，仅有52.63%的DPPH自由基清除能力。

（4）DPPH薄层色谱

图7 5k以下蛋白肽DPPH薄层色谱

从图7可以看出，木瓜蛋白酶组的抗氧化活性最好，其后依次为市售A组、市售B组、贯筋藤酶组。

2.2.2 抑菌活性

（1）李斯特菌抑菌率

图8 李斯特菌抑菌率

由图8可知，各浓度的贯筋藤酶组蛋白肽均对代表革兰氏阳性菌的李斯特菌抑菌能力最强。在浓度为25mg/mL的浓度下，贯筋藤酶组的抑菌率高达86.33%，市售B组干酪的蛋白肽对李斯特菌的抑菌能力较弱。

（2）沙门氏菌抑菌率

图9 沙门氏菌抑菌率

由图9可知，市售A组与木瓜蛋白酶组对革兰氏阴性菌沙门氏菌的抑菌效果最好，在浓度为25mg/mL时抑菌率分别为61.87%和61.68%；贯筋藤组对沙门氏菌的抑菌能力相对较弱，为55.36%。四种干酪的不同浓度蛋白肽对李斯特菌、沙门氏菌均有抑制作用。

3 结论

经过单因素试验与二次通用旋转试验确定了料液比为26∶1、匀浆时间为5min、转速10×1000r/min时为蛋白肽最佳提取工艺（蛋白肽提取率最高）。通过测定最佳提取条件下蛋白肽的抗氧化活性及抑菌作用，贯筋藤凝乳酶和木瓜蛋白酶加工得到的水牛奶奶酪中的蛋白肽具有较好的ABTS、DPPH自由基清除能力及铁离子还原能力；水牛奶干酪蛋白肽对李斯特菌、沙门氏菌均有良好的抑制作用。此研究表明水牛奶奶酪中富含功能活性肽，具有很大的开发价值。