蓝狐脑炎原虫病的诊断与鉴定

李 志，刘丽凡，穆国冬，章悟善，张媛媛，黄巧蓉，马澳琳，谢路遥，王 好

(1.吉林农业大学动物科学技术学院，吉林长春130118 ； 2.长春科技学院，吉林长春130600 ；3.吉林省动物疫病预防控制中心，吉林长春130000 ； 4.吉林大学人兽共患病研究教育部重点实验室，吉林长春130062)

2017年5月初，吉林省九台市某蓝狐养殖场养殖的1-4月龄蓝狐出现不同程度脱水、生长停滞，眼睛失明，腹部触摸可以摸到肿大的肾脏，被当地人称之为“大肾病”。尽管蓝狐大肾病的流行已有报道，但由于该病发生原因复杂，病毒、血液附红细胞体检测未出现异常，并未检测出病原[1]。本实验室怀疑蓝狐发病为狐脑炎原虫病，并去当地收集病狐进行临床诊断和实验室诊断。

1 材料与方法

1.1 试验材料 革兰染色液、改良马松三色染色液、质粒小量提取试剂盒,购自北京索莱宝科技有限公司；ExTaqDNA聚合酶、pMD18-T 载体和限制性内切酶EcoR I、HindIII，购自TaKaRa 公司；E.coliDH5α，购自北京全式金生物技术有限公司；DNA 胶回收试剂盒，购自天根生化科技有限公司。

1.2 病料样品的采集和处理 5例病料样品采集于吉林省九台地区某农场，为发病蓝狐的肾脏、脑组织，-20 ℃冰箱冷冻保存；部分新鲜肾脏组织10%甲醛固定用于制备石蜡切片。

1.3 脑炎原虫的纯化和电镜观察 无菌条件下取5例典型病变的肾脏组织研磨，加入磷酸盐缓冲液稀释，并使用200 μm筛网过滤。滤液差速离心，操作如下：300 r/min离心5 min，收集上清液；将上清液4 000 r/min离心10 min，多次重复操作，收集底部沉淀，加少量磷酸盐缓冲液，透射电子显微镜下观察并拍照。

1.4 病理切片染色 将10%甲醛固定的组织室温放置1周；经过脱水、包埋、修块、切片、革兰染色和改良马松三色染色等步骤后，盖玻片固定保存，观察病理变化。

1.5 PCR鉴定及序列分析

1.5.1 引物设计与合成 参考GenBank 登录的脑炎原虫基因组序列，选取ITS1、PTP1基因序列保守区域，应用Primer 5.0软件设计引物。PITS1F:5′-TTGACGGAAGGACACCACAAGGAGT-3′，PITS1R: 5′-CC-CGCCAAACGCAGTTACCA-3′；PPTP1F：5′-CCGGAATTCATGTATTCAGCAACCGCA-3′ ，PPTP1R：5′-CCGCTC GAGTTACTAGCAGCATTGG-3′。PCR 扩增产物预期为762 bp、1 128 bp。引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。

1.5.2 DNA的提取与PCR 鉴定 将肾脏、脑组织研磨液分别处理。反复冻融3次，碱裂解法提取DNA，并进行PCR 扩增。ITS1基因的PCR 反应条件为：95 ℃ 5 min；94 ℃ 30 s、62.3℃ 30 s、72 ℃ 30 min， 30个循环；72 ℃ 10 min。PTP1基因的PCR 反应条件为：95 ℃ 5 min；94 ℃ 30 s、60.4 ℃ 30 s、72 ℃ 30 min， 30个循环；扩增产物以1%琼脂糖凝胶电泳鉴定。

1.5.3 目的基因的回收与连接 PTP1基因PCR产物经纯化后连接于pMD18-T载体中，转化E.coliDH5α感受态细胞，在含有氨苄青霉素终浓度100 μg/mL的LB 琼脂平板上筛选单菌落，LB培养基中180 r/min振荡培养过夜，提取重组质粒，并使用限制性内切酶EcoR I和HindIII进行双酶切验证。

1.5.4 序列比较及进化树绘制 阳性重组质粒由北京六合华大基因科技股份有限公司进行序列测定。利用DNASTAR软件将基因测序结果与GenBank 登录的参考病毒株进行序列同源性分析并采用MEGA 7.0构建系统进化树。

2 结果

2.1 临床诊断结果 受感染的农场主要以蓝狐养殖为产业，典型症状为食欲不振、生长停滞、失明、痉挛，并且该疾病可经垂直传播(见中插彩版图1)。大多数受感染的狐狸，经剖检可观察肾脏苍白、肿大(见中插彩版图2)。

图1 生长停滞的4月龄蓝狐

图2 病狐肾脏肿大苍白症状

2.2 病原的纯化结果 取初步纯化的菌株经革兰染色、改良马松三色染色，油镜观察。革兰染色观察，在细胞碎片凝集物周边有大量深蓝色圆形或椭圆形类似假囊的结构；改良马松三色染色呈粉红色，大小在1～2 μm左右(见中插彩版图3)。

图3 经初步纯化的微孢子虫的染色

2.3 病理观察结果 为了进一步鉴定脑炎原虫病，将固定的组织做石蜡病理切片并染色，400倍显微镜下观察，在肾脏间质和肾髓质明显观察到孢子存在。革兰染色观察到肾上皮内和腔内以及脾脏小梁的孢子显示为粉红色背景下可见的深蓝色圆形结构(见中插彩版图4A和4C箭头所指)。改良马松三色染色可观察到肾小管上皮内蓝色背景下大量粉红色卵圆形结构(见中插彩版图4B箭头所指)。

图4 蓝狐组织染色观察

2.4 PCR鉴定与序列分析结果

2.4.1 PCR鉴定结果 将ITS1 基因、PTP1基因进行PCR 扩增，产物凝胶电泳检测结果显示，扩增出约831 bp、1 071 bp的特异性片段(图5)。将其连接至pMD18-T载体中，送生工生物工程(上海)股份有限公司测序。

图5 分离株PTP1、ITS1基因PCR扩增产物

M：.DL-2 000 DNA Marker ； 1：阴性对照 ；2：ITS1扩增产物 ； 3：PTP1-pMD-18T酶切产物

2.4.2 基因序列分析结果 对测序结果进行分析，PTP1、ITS1基因在GenBank上进行比对。结果表明，ITS1基因与参考株GB-M1的同源性为99.7%，并且ITS1基因5′-GTTT-3′重复4次，与LN-1株同属一个基因III型，将分离株命名为JL-1。同时，PTP1基因进化树分析也表明该分离株与辽宁株(LN-1) 及美国株(CDC)亲缘关系最近(图6)。其中NM001041403、AJ005666、AF310678基因分离自小鼠，EU282236、EU282237和AB182700分离自猴子，AF310679分离自人。

图6 基于Neighbor-Joining 法构建立 PTP1基因核苷酸序列遗传进化树

3 讨论

经实验室诊断分析，确定该蓝狐养殖场暴发的疾病为脑炎原虫病。

在实验室诊断的多个肾脏、脑组织石蜡切片染色、研磨液中检测到大量脑炎原虫，证明脑炎原虫极有可能寄生在蓝狐肾脏并排出具有感染性的孢子，经口腔感染给同群蓝狐。同时，蓝狐发病的窝发性和母狐的发病史也证明了该病传播与遗传有关，脑炎原虫可能经胎盘传播给子代。肾脏、脑组织DNA的PCR鉴定，经ITS1基因序列分析证明了蓝狐脑炎原虫基因Ⅲ型感染。2012年初，中国首次出现蓝狐脑炎原虫基因Ⅲ型，但传染来源无从知晓。在欧洲，只有脑炎原虫基因Ⅲ型感染犬、猴、免疫缺陷病人和肾脏移植患者[2-4]。因此此次蓝狐脑炎原虫病的暴发有潜在的人兽共患风险，特别是对免疫能力较弱的老人和儿童。

目前脑炎原虫病尚未有特效治疗药物。仅发现某些抗生素(例如：烟曲霉素，司帕沙星，土霉素)，特别是苯并咪唑对脑炎原虫感染能够起到一定抑制作用[5]。但在治疗中断几个月后，往往会在宿主体内再次检测到脑炎原虫[6]。因此感染脑炎原虫病的蓝狐特别是母狐必须淘汰，并使用浓度为1.0%甲醛、1.0%过氧化氢、1.0%氢氧化钠、70%乙醇、10%次氯酸钠等常规消毒剂对养殖区域进行定期彻底的清洁，减少病原传播。

东北地区是毛皮动物养殖的主要分布地区之一，占有非常重要的地位。蓝狐对脑炎原虫病高度易感，但在国内仅有1例蓝狐感染报道。并且脑原虫病可能已在狐场肆虐几年，在最初只有数只幼狐感染，后来50%幼狐死亡，由于不能有效控制疫情，养殖户不得不处死母狐。在2002年，脑炎原虫病造成了芬兰蓝狐的高死亡率和巨大的经济损失[7]。因此，此次狐场的兔脑原虫调查极为重要。