桂林地区致仔猪腹泻大肠杆菌血清型鉴定与耐药性分析

李劲松，唐建华，向阳鸿

(1.桂林市动物疫病预防控制中心，广西桂林541001 ； 2.西南大学动物科学学院 ，重庆荣昌402460 ； 3.重庆方通动物药业有限公司，重庆荣昌402460)

近几年，仔猪的腹泻病成为临床中常见的疾病之一，主要由传染性病原感染以及非传染性因素等引起，传染性因素包括细菌、病毒以及其他病原的感染，其中细菌引起的仔猪腹泻在仔猪感染性腹泻中占有较大比重，尤其致病性大肠杆菌和沙门菌引起的仔猪腹泻临床中最为常见，其感染率和死亡率均较高，给养殖户造成严重的经济损失。致病性大肠杆菌可以引起家畜、家禽等多种动物及人发病，为重要的人兽共患病原菌。仔猪大肠杆菌病是由某些致病性血清型大肠杆菌引起仔猪腹泻的一类传染性疾病的总称，根据其致病性大肠杆菌的病原类型、临床症状表现、病理剖检及流行病学特征的不同，可以分为仔猪黄痢、仔猪白痢和仔猪水肿病，其中，临床上以仔猪黄白痢发病率和死亡率较高，给养猪业造成了巨大的经济损失，严重影响我国养猪业的发展[1-2]。由于大肠杆菌血清型众多，给疫苗的研制带来很大困难，抗生素成为防治大肠杆菌主要手段，在养猪的过程中抗生素不合理的使用，产生很强的耐药性，降低了治疗效果，同时造成猪肉等畜产品中严重的药物残留，威胁人类的健康，应引起重视[3]。

本试验从桂林地区不同养猪场中，采集患腹泻仔猪肝脏、肛拭子及粪便等病料组织，共分离到67株大肠杆菌，对分离的67株大肠杆菌的致病性、血清型及耐药性进行分析，为该地区的仔猪腹泻性大肠杆菌病的防治提供参考依据。

1 材料

1.1 病料来源 桂林地区不同养猪场无菌采集的患腹泻病仔猪肝脏、肛拭子及粪便等病料组织样品103份。

1.2 试剂与仪器 麦康凯培养基、伊红美蓝培养基、MH培养基、营养肉汤培养基，均购自北京陆桥生物技术有限责任公司；革兰染色试剂盒购自青岛高科园海博生物技术有限公司；药敏纸片购自北京天坛药物生物技术开发公司；E.coli标准O型血清因子购自中国兽医药品监察所；ID32E肠杆科菌鉴定试剂条购自法国梅里埃生物技术公司； ATB自动生化鉴定系统仪由法国梅里埃生物技术公司生产；恒温培养箱由上海经济区沈荡中新电器有限公司生产；多功能梯度 PCR仪(VeritiTm 96-Well Thermal型)由美国 ABI 公司生产；常规的仪器及试剂均由桂林市动物疫病预防控制中心实验室以及重庆方通动物药业有限公司提供。

1.3 实验动物 (25±2)g昆明系小鼠340只，购自重庆方通动物药业有限公司。

2 方法

2.1 细菌的分离培养 无菌采集的患病仔猪肝脏、肛拭子和粪便等病料组织样品103份接种麦康凯培养基上，置37 ℃培养箱中培养12-18 h，选取单个优势菌落接种于鉴别培养基伊红美蓝平板上培养，挑取伊红美蓝培养基上的单个菌落接种于营养肉汤中进行纯化培养， 37 ℃摇床震荡培养12 h后，革兰染色观察分离菌株的形态学。

2.2 细菌生化试验鉴定 按照ID32E肠杆科菌鉴定试剂条说明书，将纯化培养后的分离菌株通过比色法调整菌液浓度为0.5麦氏浊度，加入ID32E肠道菌鉴定试条中 37 ℃培养12-24 h，用ATB自动生化鉴定系统仪对分离菌株进行生化试验鉴定。

2.3 细菌PCR鉴定及测序 参考文献[4]，设计细菌的16S rRNA基因序列通用引物5′-CCGTCTTCAGTTCCAGTGTG-3′/5′-GTGGCGGACGGGTGAGTAA-3′，由华大生物工程有限公司合成。用水煮法制备分离菌株的基因组DNA模板，对分离菌株进行PCR鉴定。 PCR增反应体系(50 μL)：2×TaqMarker Mix 25 μL，引物P1、P2各1 μL，DNA模板2 μL，ddH2O 21 μL。反应条件：94 ℃预变性5 min；94 ℃变性1 min，58.5 ℃退火50 s，72 ℃延伸50 s，72 ℃终延伸10 min，共30个循环。用1%琼脂糖检测分离菌株的目的条带后，将分离菌株的PCR扩增产物送华大生物工程有限公司测序，测序结果与GenBank中登录的基因序列进行同源性比较。

2.4 致病性试验 将分离菌株培养至对数期，调整菌液浓度为108CFU/mL；每1株分离菌株攻毒5只小鼠，每只小鼠通过灌胃的方式攻毒，剂量为0.25 mL(108CFU/mL)，空白对照组用同样方法给予等量的营养肉汤；腹腔注射等量的灭菌的生理盐水。在攻毒12 h后，观察7 d，记录每个试验组小鼠的发病及死亡情况，并对于死亡的小鼠进行细菌分离鉴定。

2.5 分离株血清型鉴定 参考文献[5]，用E.coli标准O型血清因子进行玻片凝集试验检测致病性大肠杆菌的血清型。

2.6 分离菌株的药敏试验 按照美国临床检验标准委员会(NCCLS)推荐的标准K-B纸片法进行操作，结果判断。

3 结果

3.1 细菌的分离鉴定结果 在麦康凯琼脂培养基上长出边缘光滑整齐的、湿润的、粉红色扁圆的菌落；在伊红美兰培养基上长出深紫黑色或者褐色并带金属光泽、圆形菌落；革兰染色为阴性、两端钝圆的杆状菌。与报道的大肠杆菌培养特性和形态学一致。通过统计103份样品中67株分离菌株疑似大肠杆菌。

3.2 细菌生化鉴定结果 分离菌株V-P试验为均阴性、吲哚试验均为阳性，能发酵甘露醇、葡萄糖、海藻糖、麦芽糖、阿拉伯糖、鼠李糖，产酸不产气；将培养的ID32E肠杆科菌鉴定试剂条放入ATB全自动生化鉴定系统进行生化鉴定分析，结果显示，67株分离菌株均鉴定为大肠杆菌，系统评定合格率在98.9%～99.9%之间。67株分离菌株生化特性与报道的大肠杆菌的生化特性一致。

3.3 细菌的PCR鉴定结果 用细菌的16S rRNA基因序列通用引物对分离菌株进行了PCR鉴定，67株分离菌株均扩增出大约为1 492 bp左右的目的基因的条带(见图1)。67分离菌株测序结果后与GenBank中登录的参考株大肠杆菌的基因序列同源性在98.9%～99.9%之间，因而证实了67株分离菌株为大肠杆菌。

图1 部分分离菌株PCR鉴定结果

M:DL-2 000 Marker ; 1-7:分离菌株

3.4 致病性试验结果 试验组攻毒的小鼠在攻毒后的48-72 h出现不同程度的死亡，在死亡的小鼠肝脏组织中分离到大肠杆菌。直到试验结束(7 d)，对照组5只小鼠未出现明显的变化。通过致病试验统计与分析，67株分离菌中52株大肠杆菌分离株对小鼠致死率为100%，为致病性大肠杆菌。

3.5 血清型检测结果 结果见表1。52株仔猪致病性大肠杆菌分离株共包括属于12个血清型，定型菌株为52株，占分离菌株的77.6%(52/67)；其中，以O149、O109和O9为流行的优势血清型，分别占仔猪致病性分离菌株的21.2%、15.4%、13.5%和11.5%。

表1 52株致仔猪腹泻性大肠杆菌血清型检测结果

3.6 耐药性分析结果 结果见表2。52株仔猪致病性大肠杆菌分离株存在着严重的耐药性，呈现多重耐药。对阿莫西林、磺胺间甲氧嘧啶、新霉素3种药物的耐药率最高，高达100%；对环丙沙星、恩诺沙星、氨苄西林3种药物的耐药率在88.4%～98.1%之间；对阿米卡星、林可霉素、庆大霉素、多粘菌素、强力霉素、大观霉素6种药物的耐药率在51.9%～75.0%之间；对头孢克肟、头孢他啶、氟苯尼考3种药物耐药性在23.1%～48.1%之间。

表2 52株致仔猪腹泻性大肠杆菌耐药性分析结果

4 讨论

仔猪大肠杆菌病为养猪过程中常见的细菌性传染病之一，该病可以引起仔猪严重腹泻，导致仔猪严重生长发育受阻，增重缓慢，临床中引起仔猪黄白痢大肠杆菌主要是肠毒素性大肠杆菌(ETEC)，感染率和死亡率较高，严重影响着养猪业发展[6]。近几年，关于致病性大肠杆菌引起仔猪腹泻的报道越来越多，应引起重视。本试验从桂林地区不同的养殖场中，采集了103份患腹泻仔猪肝脏、肛拭子和粪便等病料组织样品中分离到了52株致病性大肠杆菌，从而证实了桂林地区不同的养殖场中致仔猪腹泻性大肠杆菌广泛流行，应引起重视并进行合理的防治。

由于大肠杆菌血清型众多，具有多样流行性，不同血清型间菌株之间缺乏有效的交叉免疫保护性，目前没有理想疫苗对该病进行预防[5]。因此，导致仔猪致病性大肠杆菌流行。本试验分离的52株仔猪致病性大肠杆菌属于12个血清型，其中，以O149、O109和O9为流行的优势血清型。从而证实该地区仔猪致病性大肠杆菌流行的血清型复杂，具有多样性。吴利军等[6]报道了湖北地区规模化养殖场中仔猪腹泻性大肠杆菌的流行血清型以O4、O55、O119为主。孙晓锴[7]报道了重庆地区的仔猪源大肠杆菌流行的血清型为O101、O8、O20、O64、O45、O149。王鹏等[8]报道了四川地区猪水肿病致病性大肠杆菌以O139主要的流行血清型。仔猪腹泻性大肠杆菌的流行血清型与地区有关，不同地区分离的大肠杆菌流行的血清型也不同，其致病性也存在一定的差异性。

大肠杆菌具有易产生耐药性的特点，由于抗生素的不合理的使用，造成严重的耐药性，且耐药谱型不断的增大。本试验耐药性分析结果表明，52株仔猪致病性大肠杆菌分离株存在着严重的耐药性，呈现多重耐药。对阿莫西林、磺胺间甲氧嘧啶、新霉素3种药物的耐药率高达100%；对环丙沙星、恩诺沙星、氨苄西林3种药物的耐药率在88.4%～98.1%之间；对其他药物耐药率在在51.9%～75.0%之间；对头孢克肟、头孢他啶、氟苯尼考3种药物耐药性相对较低，在23.1%～48.1%之间。与吴利军等[6]、郭潇木等[9]、马长宾等[10]的报道存在一定差异性，可能与地区流行的致病性大肠杆菌有关，还可能与用药情况有关。因此，当仔猪发生该病时，应进行药敏试验，合理使用药物预防与治疗，提高治疗效果，同时要加强平时的饲养管理。