异维A酸对肽聚糖诱导的SZ95人皮脂腺细胞相关炎症基因表达的影响

曹珂 侯霄枭 李昕 Christos C.Zouboulis 鞠强

1上海交通大学医学院附属仁济医院皮肤科 200127；2Departments of Dermatology,Venereology,Allergology and Immunology,Dessau Medical Center,Brandenburg Medical School Theodore Fontane，Dessau 06847,Germany

寻常痤疮是毛囊皮脂腺慢性炎症性疾病，炎症贯穿痤疮发生的始终。痤疮丙酸杆菌（Propionibacterium acnes）通过活化Toll样受体2（Toll-like receptor，TLR2）诱导天然免疫反应及炎症因子如白细胞介素（IL）1α、IL-1β、IL-6、IL-8以及肿瘤坏死因子（TNF）释放，在痤疮炎症进程中起核心作用［1］。异维A酸具有抑制皮脂腺脂质合成、改善毛囊皮脂腺导管角化、间接抑制P.acnes增殖及抗炎作用，是目前发现的唯一可以同时影响痤疮4个主要发病环节的药物［2］。近来对异维A酸的抗炎作用研究多集中于患者治疗后的血清学检测或者外周血单核细胞因子表达变化［3-5］，体外针对痤疮发生中具有核心作用的皮脂腺细胞免疫和炎症的调节作用特别是对TLR2介导的天然免疫通路影响的相关研究仍然缺乏。为此，我们探讨异维A酸体外对革兰阳性细菌（包括P.acnes）壁主要成分肽聚糖诱导的SZ95人皮脂腺细胞中与痤疮发病可能相关的炎症因子的表达释放和TLR2基因及其下游MyD88（myeloid differentiation factor 88）基因表达的影响，探讨异维A酸在痤疮治疗中抗炎作用的分子机制。

材料与方法

一、试剂和仪器

肽聚糖［美国Sigma公司，纯度≥98%（高效液相色谱法测定）］来源于金黄色葡萄球菌细胞壁提取物，用磷酸盐缓冲液（PBS）配制成20 g/L混悬液，分装后-20℃备用；异维A酸［美国Sigma公司，货号R3255，纯度≥98%（高效液相色谱法测定）］，溶解于二甲基亚砜（DMSO）中，配制成10-2mol/L，分装后-20℃备用，使用时用工作培养基调至所需浓度，控制DMSO浓度≤1‰（体积分数）。胰酶（美国Gibco公 司），Trizol RNA提 取 试 剂（美 国Invitrogen公司），反转录酶试剂盒（日本TaKaRa公司），实时荧光定量PCR试剂盒（美国BioRad公司），酶联免疫吸附试验（ELISA）试剂盒（武汉博士德公司），兔抗人TLR2、MyD88、甘油醛-3-磷酸脱氢酶（GAPDH）一抗（美国CST公司），辣根过氧化物酶标记的山羊抗兔二抗（美国CST公司），BCA蛋白分析试剂盒（美国Thermo公司），化学发光试剂盒（美 国BioRad公 司）。ViiA7实 时PCR仪（Applied Biosystems™，美国Thermo公司），多功能酶标仪（美国BioTek公司）。

二、细胞培养

SZ95人皮脂腺细胞由德国Dessau临床医学中心皮肤科Zouboulis教授馈赠，将经30～40次传代的细胞用于实验。用Sebomed基础培养基（德国Biochrom公司）培养SZ95细胞，添加10%胎牛血清、5 μg/L表皮生长因子、100 U/ml青霉素、100 mg/L链霉素（均来自美国Gibco公司）、1 mmol/L CaCl2（美国Sigma公司）。置于37℃、5% CO2培养箱中，每两天更换1次培养液。新鲜配制工作培养基。

三、实时荧光定量PCR（RT-PCR）检测细胞中IL-1α、IL-1β、IL-6、IL-8、TNF-α以及TLR2和MyD88 mRNA水平

将SZ95细胞接种于24孔板（1×105个/孔），培养24 h后分成3组，对照组不做处理，另外两组分别用20 mg/L肽聚糖［6］单独（肽聚糖组）或联合10-5mol/L异维A酸［7］（共刺激组）共同处理。作用3 h后，胰酶消化收集细胞，用Trizol试剂提取总RNA，使用TaKaRa试剂盒按照说明书逆转录获得cDNA，检测基因及引物序列见表1。以GAPDH作为内参照。RT-PCR反应条件：95℃预变性30 s；95℃变性5 s，60℃退火30 s，循环45次，于60℃时收集数据。目的基因mRNA相对表达量以2-ΔΔCt表示，ΔCt=Ct目的基因-CtGAPDH，ΔΔCt=ΔCt目的基因-ΔCt对照组。

四、ELISA检测细胞培养上清液中IL-1α、IL-1β、IL-6、IL-8以及TNF-α分泌量

将SZ95细胞接种于24孔板中（1×105个/孔），次日PBS清洗后，分组和处理同上，24 h后收集细胞上清液，4℃300×g离心后收集上清液分装，-20℃保存。按照ELISA试剂盒说明书操作检测，并设定空白对照孔，酶标仪检测各孔450 nm处吸光度（A值）。根据标准曲线计算样本浓度。

五、Western印迹检测细胞中TLR2和MyD88蛋白水平

将SZ95细胞接种于6孔板中（1×106个/孔），24 h后待细胞融合度达到80%以上时，PBS清洗，分组和处理同上，继续培养48 h后，RIPA裂解液提取总蛋白，刮下细胞并转移至1.5 ml微量离心管中，冰上裂解30 min，使蛋白充分裂解，10 000×g离心5 min，吸取上清液留存，弃沉淀。BCA试剂盒测定蛋白浓度，调整蛋白浓度，加入5×十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳蛋白上样缓冲液，煮沸变性。采用聚丙烯酰胺凝胶电泳分离蛋白，将分离后的蛋白转至聚偏二氟乙烯膜上，封闭液封闭1 h，TBST洗膜3次，每次10 min。加入兔抗人TLR2、MyD88、GAPDH一抗，4℃孵育过夜，加入羊抗兔二抗室温孵育2 h，化学发光系统ECL试剂盒显影成像。

表1 实时荧光定量PCR检测基因及引物序列（5′-3′）

六、数据处理

结果

一、异维A酸抑制肽聚糖诱导的SZ95细胞IL-1α、IL-1β、IL-6、IL-8及TNF-α mRNA表达

见表2。作用3 h后，对照组、肽聚糖组和共刺激组间IL-1α、IL-1β、IL-6、IL-8及TNF-α mRNA表达差异均有统计学意义（均P＜0.01），肽聚糖组上述指标均高于对照组（均P＜0.016 7）和共刺激组（均P＜0.016 7）。

二、异维A酸对肽聚糖诱导的SZ95细胞分泌IL-1α、IL-1β、IL-6、IL-8以及TNF-α蛋白的影响

见表3。作用24 h后，对照组、肽聚糖组和共刺激组间上清液中IL-1α、IL-1β、IL-6、IL-8及TNF-α蛋白水平差异均有统计学意义（均P＜0.01），肽聚糖组上述指标均高于对照组（均P＜0.0167）和共刺激组（均P＜0.016 7）。

三、异维A酸对肽聚糖诱导的SZ95细胞TLR2和MyD88 mRNA和蛋白表达的影响

见图1。作用3 h后，对照组、肽聚糖组和共刺激组间MyD88 mRNA表达差异有统计学意义（F=10.17，P＜0.01），肽聚糖组高于对照组（t=4.740，P＜0.016 7）和共刺激组（t=3.298，P＜0.0167）。作用48 h后，3组间MyD88蛋白表达差异有统计学意义，肽聚糖组高于对照组和共刺激组。肽聚糖组TLR2 mRNA（t=7.071，P＜0.016 7）和蛋白表达水平均明显高于对照组，而与共刺激组无显著差异。

表2 异维A酸体外对肽聚糖诱导的SZ95人皮脂腺细胞IL-1α、IL-1β、IL-6、IL-8、TNF-α mRNA表达的影响（2-ΔΔCt）

表3 异维A酸体外对肽聚糖诱导的SZ95细胞分泌IL-1α、IL-1β、IL-6、IL-8、TNF-α蛋白的影响（ng/L）

图1 异维A酸对肽聚糖诱导的人皮脂腺细胞Toll样受体2（TLR2）和MyD88 mRNA（1A、1B）和蛋白（1C）表达的影响a：P＜0.016 7

讨论

研究显示，痤疮患者外周血单核细胞高表达TLR2［3-4］，且TLR2信号通路介导的天然免疫反应在痤疮发病中起重要作用。P.acnes通过激活角质形成细胞及皮脂腺细胞中TLR2及其下游MyD88和核因子κB（NF-κB），诱导相关因子如IL-1α、IL-1β、TNF-α、IL-6、IL-8等表达上调和释放被认为是痤疮发生发展的重要信号通路。炎症发生与毛囊皮脂腺导管角化、皮脂腺脂质分泌等也密切相关［8-9］。作为病原相关分子模式，肽聚糖是革兰阳性细菌（包括P.acnes）细菌壁的主要成分，是细胞表面天然免疫分子TLR2的天然配体和激活剂［10］，常被用于体外痤疮炎症模型的刺激物。

异维A酸在皮脂腺细胞内能特异性转化为全反式维A酸，并蓄积在细胞内作用于维A酸受体RAR（retinoic acid receptor）及RXR（retinoid X receptor），独特的分子作用机制使其可以通过调节细胞增殖、分化和凋亡而具有强大的抑制皮脂腺分泌活性［2］。异维A酸对痤疮免疫和炎症的调控作用是近年来药物作用机制的研究热点，研究显示其可以抑制中性粒细胞迁移、溶酶体酶释放、花生四烯酸代谢及白三烯和一氧化氮等炎症介质生成，并抑制基质金属蛋白酶（MMP）-9、MMP-13及MMP-2的活性等［11］；痤疮患者血清TNF-α、IL-4、IL-17和IFN-γ的基线水平显著高于对照组，但在接受异维A酸治疗后显著降低［12］；异维A酸也被发现可以下调痤疮患者外周血单核细胞TLR2的表达［13］。我们在肽聚糖诱导的人皮脂腺细胞炎症模型上发现，异维A酸明显下调IL-1α、IL-1β、IL-6、IL-8、TNF-α的表达，提示异维A酸对炎症因子具有调控作用。

异维A酸可以抑制黑素瘤细胞中NF-κB p65、p50、c-Rel亚基和其他转录因子如c-fos、活化的转录因子2和环腺苷的活化和核转位，从而抑制内皮细胞迁移以及血管生成［14］。在小鼠肺泡癌Line 1细胞系中NF-κB的过度活化可以通过全反式维A酸过度激活RAR来抑制［15］。在小鼠脂肪细胞中，全反式维A酸的抗炎作用与NF-κB途径中两个亚基IκB和p65的磷酸化水平降低相关［16］。RXRα配体抑制NF-κB激活后TNF-α的表达，从而诱导MCF-7人乳腺癌细胞的凋亡［17］。全反式维A酸能诱导人胚胎癌细胞MyD88表达下调，而MyD88依赖TLR通路激活NF-κB［18］。全反式维A酸还能通过RARβ调节TLR4来改善大鼠和小鼠模型中肠上皮屏障功能［19］。前期研究证实肽聚糖诱导SZ95细胞MyD88表达增高［6］，我们进一步对相关信号通路的研究发现，异维A酸对肽聚糖诱导的人皮脂腺细胞的TLR2表达没有产生影响，但下调其下游关键基因MyD88的表达，提示异维A酸可能在皮脂腺细胞质内通过某种交联直接作用于MyD88而非通过影响细胞膜上TLR2表达来发挥抗炎作用。由于异维A酸在细胞质内通过转化为全反式维A酸作用于维A酸受体而发挥作用［7］，未来需要进一步研究异维A酸下调MyD88基因表达的机制。

总之，我们采用肽聚糖体外刺激人皮脂腺细胞构建皮脂腺细胞炎症模型，发现肽聚糖明显促进皮脂腺细胞分泌与痤疮发病可能相关的炎症因子，而异维A酸能够显著抑制肽聚糖诱导的这些炎症因子mRNA和蛋白表达，并且抑制肽聚糖诱导的TLR2下游分子MyD88而非TLR2本身的表达。异维A酸抑制肽聚糖诱导的天然免疫反应可能是其治疗痤疮的机制之一，进一步探索异维A酸如何作用于MyD88及其他相关炎症基因并影响天然免疫信号通路有助于进一步揭示异维A酸的抗炎机制，指导临床合理用药。

利益冲突所有作者均声明不存在利益冲突