紫外线及全反式维A酸对人皮肤及成纤维细胞中Hrd1表达的影响

成仙叶 钱雯 金轶 李谢伦 苏东明 陈斌

1南京医科大学第一附属医院皮肤科 210029；2南京医科大学代谢疾病研究中心 210029

紫外线照射可以引起皮肤成纤维细胞产生大量活性氧（reactive oxygen species，ROS）［1-2］，促发细胞内内质网应激（ER stress），这一过程在紫外线诱导的皮肤损伤中发挥重要作用［3-4］。内质网应激通过激活内质网相关蛋白降解（ER-associated degradation，ERAD），促进内质网内未折叠或错误折叠蛋白质的降解［5］。羟甲基戊二酰辅酶A还原酶降解蛋白1（Hrd1）是ERAD过程中一种重要的E3泛素连接酶，可以通过介导多种蛋白质降解，在肾纤维化、类风湿性关节炎、肝硬化等疾病的发生发展过程中发挥重要作用［6-8］，同时不少研究证实，Hrd1是多种抗光老化蛋白质［如NF-E2相关因子2（Nrf2）、胰岛素样生长因子1受体（IGF-1R）］的特异性E3泛素连接酶，介导其泛素化降解［7，9］。我们前期研究发现，紫外线照射可明显促进皮肤成纤维细胞内Hrd1的表达［10］。为了进一步证实Hrd1是否参与光老化的发生，我们通过收集临床标本及建立小鼠光老化模型，进一步明确紫外线照射与皮肤Hrd1表达水平的关系。全反式维A酸（ATRA）是临床上公认的可治疗光老化的外用药物，其机制包括抑制激活蛋白-1转录因子、抑制基质金属蛋白酶（MMP）的表达及增加真皮胶原纤维量［11］。本研究通过在动物和细胞学实验中加入ATRA处理，观察ATRA处理后Hrd1的表达，探索ATRA治疗皮肤光损伤的分子机制。

材料与方法

一、主要试剂与仪器

Hrd1（SYVN1）一抗（兔抗人多克隆抗体，美国Abcam公司）、PV-6000试剂盒（北京中杉金桥有限公司）、羊抗兔二抗（美国Thermo公司）、ATRA（R2625，美国Sigma公司，纯度＞98%，用二甲基亚砜溶解配制）、噻唑蓝（MTT）（美国Sigma公司）、ROS检测试剂盒（上海碧云天生物技术有限公司）、Bio-spectra紫外照射系统（法国Vilber Lourmat公司）、荧光显微镜（DP70，日本东京Olympus公司）。清洁级BALB/c小鼠由上海斯来克实验动物中心，合格证号SCXK（沪）2007-0005，动物实验许可证号220181352。江苏省疾病控制中心（SPF）动物实验室喂养，各实验组小鼠按雌雄分组分开，全价颗粒饲料喂养，饮清洁自来水，室内恒温22℃。

二、方法

1.临床标本收集：临床皮肤标本来自2017年12月至2018年6月南京医科大学第一附属医院皮肤科患者浅表良性肿物病灶周围正常皮肤，曝光部位皮肤取自面颈部及手腕，避光部位皮肤取自胸背部、大腿及臀部。标本取自12例女性，均为室内工作者，年龄32～70岁。根据年龄及部位将标本分为4组，每组3份，组1来自30～40岁曝光部位，组2来自30～40岁避光部位，组3来自60～70岁曝光部位，组4来自60～70岁避光部位。本研究通过南京医科大学第一附属医院医学伦理委员会批准（2016-SRFA-033），患者均签署知情同意书。

2.动物分组及处理：清洁级BALB/c小鼠（月龄3周，雌雄各20只）随机分为对照组、紫外线组、紫外线+ATRA组、ATRA组，每组4只。造模方法参照文献［12］，紫外线组、紫外线+ATRA组每日同时照射UVA 10 J/cm2和UVB 30 mJ/cm2；紫外线+ATRA组（照光前给药）、ATRA组小鼠在背部剃毛区每日均匀涂抹1次0.1 ml 0.1%ATRA乳膏（重庆华邦制药公司）；对照组不涂药，不照射紫外线。14周后处死小鼠并取小鼠背部脱毛区全层皮肤。

3.免疫组化检测皮肤中Hrd1表达：12份人皮肤组织和小鼠皮肤组织标本用10%甲醛固定，石蜡包埋、切片、脱蜡，抗原修复。滴加内源性过氧化物酶阻断剂，常温孵育，再滴加Hrd1一抗（浓度1∶200），4℃过夜，滴加酶标羊抗小鼠/兔IgG聚合物，37℃孵育；二氨基联苯胺染色液显色，最后复染、脱水、透明、封片。使用DP2-BSW软件分析并采集图片，用Image J软件在平均像素强度相同的区域测定染色强度即平均光密度值。

4.细胞分组：取包皮环切手术患者的包皮标本（患者均签署知情同意书），分离培养原代人成纤维细胞，方法参照文献［10］。选用4～8代处于对数生长期的细胞进行实验。细胞分为对照组、紫外线组、ATRA+紫外线组及ATRA组。紫外线组和ATRA+紫外线组照光前用PBS覆盖细胞上层，照射剂量为10 J/cm2UVA或30 mJ/cm2UVB。ATRA+紫外线组（紫外线照射后）和ATRA组用含1 μmol/L ATRA（浓度参考文献［13-14］）的DMEM培养基继续培养24 h，收集细胞用于后续实验。

5.Western印迹法检测成纤维细胞中Hrd1的表达：将各组人皮肤成纤维细胞在冰PBS中洗2遍，然后在RIPA裂解缓冲液中溶解。将含有等量蛋白的样品上样后进行十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳，将蛋白转印到硝酸纤维素膜上。室温下，用5%脱脂奶粉封闭非特异性蛋白1 h。加入Hrd1一抗，-4℃冰箱中过夜。TBST洗3次，每次5 min，加入过氧化物酶标记的二抗室温下结合1 h。采用ECL化学发光试剂反应5 min，利用凝胶自动成像仪成像。采用Image J软件进行半定量分析，数据表达为Hrd1蛋白灰度值与内参蛋白灰度值的比值。

6.细胞内ROS检测：使用ROS检测试剂盒检测各组人成纤维细胞内ROS水平。将用PBS冲洗处理后的细胞加入含有10 μmol/L CM-H2DCFDA培养液中37℃孵育30 min，无血清培养液冲洗3次。通过测定2′，7′-二氯荧光素评估ROS水平。使用荧光显微镜观察2′，7′-二氯荧光素。

三、统计学方法

结果

一、Hrd1在人体皮肤的表达

见图1。不同年龄段人皮肤标本中，均可发现成纤维细胞Hrd1的表达，30～40岁患者曝光部位皮肤组织中Hrd1表达（0.307±0.256）明显高于避光部位（0.196±0.330）（t=5.486，P=0.032）；60～70岁患者曝光部位（0.486±0.579）亦明显高于避光部位（0.199±0.375）（t=10.579，P=0.009）。

二、紫外线及ATRA对小鼠皮肤中Hrd1表达的影响

对照组、紫外线组、紫外线+ATRA组及ATRA组小鼠皮肤中Hrd1蛋白水平分别为0.189±0.015、0.288±0.017、0.187±0.020、0.226±0.021，差异有统计学意义（F=19.553，P＜0.001），紫外线组高于对照组（t=5.337，P=0.033）和紫外线+ATRA组（t=4.891，P=0.039）。见图2。

三、紫外线照射及ATRA对培养的人皮肤成纤维细胞Hrd1表达的影响（图3）

UVA照射时，对照组、紫外线组、紫外线+ATRA组及ATRA组人皮肤成纤维细胞中Hrd1蛋白水平分别为0.183±0.008、0.866±0.082、0.642±0.043、0.265±0.041，差异有统计学意义（F=120.704，P＜0.001），其中紫外线组高于对照组（t=13.437，P=0.005）和ATRA+紫外线组（t=4.341，P=0.048）。

图1 免疫组化法检测人皮肤组织中Hrd1的表达曝光部位皮肤中Hrd1较同年龄避光部位的表达明显升高（×200），左下角小图中黑色箭头处为成纤维细胞（×400）

图2 免疫组化法检测慢性紫外线照射及外用全反式维A酸（ATRA）对小鼠皮肤中Hrd1表达的影响（×400）紫外线组小鼠皮肤中Hrd1表达较对照组明显升高，ATRA+紫外线组小鼠皮肤中Hrd1表达较紫外线组明显下降（红色箭头处为成纤维细胞）

UVB照射时4组人皮肤成纤维细胞Hrd1蛋白水平分别为0.424±0.007、1.036±0.077、0.691±0.036、0.356±0.062，差异亦有统计学意义（F=102.119，P＜0.001），其中紫外线组高于对照组（t=12.524，P=0.006）和ATRA+紫外线组（t=9.920，P=0.01）。

四、紫外线及ATRA对人皮肤成纤维细胞内ROS水平的影响（图4）

图3 Western印迹法检测紫外线及全反式维A酸（ATRA）对人成纤维细胞中Hrd1表达的影响紫外线组Hrd1的蛋白水平均高于对照组，ATRA+紫外线组Hrd1蛋白水平均低于紫外线组

图4 紫外线及全反式维A酸（ATRA）对细胞内活性氧（ROS）水平的影响4A：荧光显微镜观察各组内ROS生成情况；4B、4C：各组ROS水平统计结果。a：P＜0.01；b：P＜0.05

UVA照射时，对照组、紫外线组、紫外线+ATRA组、ATRA组间人皮肤成纤维细胞内ROS水平差异有统计学意义（F=51.214，P＜0.001），紫外线组高于对照组（t=16.233，P=0.001）和ATRA+紫外线组ROS水平低于紫外线组（t=5.619，P=0.011）。UVB照射时，4组间ROS水平差异亦有统计学意义（F=44.735，P＜0.001），紫外线组高于对照组（t=11.925，P=0.001）和ATRA+紫外线组（t=14.557，P=0.001）。

讨论

不论是UVA还是UVB都可以促进皮肤成纤维细胞中ROS的产生，激活细胞内内质网应激［15］。为了应对内质网应激，哺乳动物细胞内会激活一系列信号通路，统称为未折叠蛋白反应（unfolded protein response）［3］，包括暂停早期蛋白质合成及诱导ERAD等。未折叠蛋白反应由位于内质网膜上的3个传感器IRE1、PERK和ATF6发出信号［16］。Hrd1又称作滑膜素（synoviolin），是未折叠蛋白反应中IRE1的下游效应器［8，17］。Xu等［9］研究发现，Hrd1通过特异性结合并降解IGF-1R抑制乳腺癌细胞的生长转移。IGF-1R也是重要的促进皮肤成纤维细胞胶原合成的分子［18］，还可增强紫外线照射后皮肤角质形成细胞的生存率［19］。Wu等［7］在研究肝硬化时发现Hrd1作为Nrf2的特异性E3泛素连接酶，通过降解Nrf2加重细胞的氧化损伤。Nrf2也是皮肤成纤维细胞中重要的抗氧化损伤蛋白［20］。目前已证实Hrd1的特异性结合底物Nrf2及IGF-1R均在抵抗皮肤光老化中发挥重要作用，而Hrd1本身在光老化中的作用还不明确。

我们在前期研究中通过用紫外线照射人皮肤成纤维细胞，发现紫外线可诱导Hrd1表达增高［10］。本次实验中，我们收集12例临床标本，发现在不同年龄段皮肤组织中，曝光部位Hrd1的表达水平明显高于避光部位；同时，在慢性紫外线照射的小鼠皮肤中Hrd1的表达也明显增高。进一步证实紫外线照射可以显著增加Hrd1的表达，也提示Hrd1可能参与光老化的发病机制。

ATRA是临床治疗光老化的经典药物［11］，其机制主要是抑制紫外线诱导的基质金属蛋白酶的产生以及促进胶原合成［21-22］。我们发现，外用ATRA乳膏处理的小鼠皮肤在慢性紫外线照射后，皮肤Hrd1的表达较单纯照光组降低。体外实验中，我们也观察到ATRA处理可以使细胞Hrd1蛋白水平较单纯照光组下降。这些结果均提示Hrd1可能是ATRA的治疗靶点。我们还验证了ATRA处理可以抑制紫外线诱导的细胞内ROS生成，结果与文献报道一致［23］。细胞内ROS的大量产生是激活未折叠蛋白反应的基础，故而推测ATRA抑制紫外线诱导的Hrd1高表达可能与ATRA抑制细胞ROS生成有关。

综上，本研究证实了紫外线照射不论在体外还是体内都可以显著提高皮肤成纤维细胞中Hrd1的表达，而ATRA可以抑制这一过程，其机制可能与ATRA抑制细胞内ROS产生有关。但Hrd1在光老化过程中发挥作用的具体机制还需要进一步探索。

利益冲突所有作者均声明不存在利益冲突