从津液角度探讨肺与大肠相表里的生物学基础※

程静 王平

（湖北中医药大学基础医学院中医基础理论教研室，湖北 武汉 430065）

《灵枢·本输》记载“肺合大肠，大肠者，传导之府”，明确指出肺与大肠的紧密关系。《黄帝内经》以降，以“肺与大肠相表里”脏腑表里相合理论，一直是中医藏象学说中最具特色的重要理论。脏腑表里相合理论认为，相表里的脏腑之间在生理状态下功能相互协调促进，而在病理状态下，相表里的脏腑之间病变往往因经络络属而相互影响。数千年来，“肺与大肠相表里”的脏腑表里相合理论一直有效地指导着中医临床实践，形成了系统的“肺病治肠”“肠病治肺”“肺肠同治”的整体疗法。本课题基于中医学津伤化燥病因病机理论和“肺与大肠相表里”的藏象理论，以检测津亏肠燥大鼠模型“肺与大肠”脏腑系统生理病理变化为主要切入点，同时观察增液承气汤对该津亏肠燥实验动物模型的干预作用，探讨中医学“肺与大肠相表里”理论的生物学基础，为阐明“肺与大肠相表里”的现代医学机制提供实验依据。

1 资料与方法

1.1 实验动物 健康SD大鼠40只，购自华中科技大学同济医学院实验动物中心，体质量（200±20）g，清洁级，雌雄各半。

1.2 药品及试剂 复方地芬诺酯（江苏平光制药有限公司生产，批号：0904141。每片含盐酸地芬诺酯2.5 mg，硫酸阿托品0.025 mg）。增液承气汤（购自湖北中医药大学附属医院国医堂门诊部。玄参30 g，麦冬25 g，生地黄25 g，大黄9 g，芒硝5 g），前3味中药用蒸馏水浸泡30 min，水煎2次后合并药液，过滤，浓缩，入大黄再煎煮3 min，最后入芒硝，蒸馏水调浓度至每1 mL相当于0.8235 g生药。大黄组参照人常用量10 g/d计算，用蒸馏水浸泡30 min后，煎煮3 min，蒸馏水调浓度至每1 mL相当于0.09 g生药。所有实验用煎剂置于4℃冰箱备用。AQP1、AQP3（美国Sigma公司，批号：2009061）。其他试剂均为市售分析纯。

1.3 仪器 电子天平MP200A（上海市第二天平仪器厂），H600透射电子显微镜（日本日立公司）。

1.4 实验方法

1.4.1 模型构建 除空白组外，其余3组应用限水联合复方地芬诺酯灌胃的方法，建立复合因素津亏肠燥大鼠模型。具体方法是：给水方法改自由饮水为灌胃给水，每天总给水量为10 mL，上午8点以浓度为10 mg/mL复方地芬诺酯药粉混悬液2 mL灌胃，中午12点灌胃给水3 mL，下午16点灌胃给水2 mL，晚上20点灌胃给水3 mL，连续限水 14 d［1］。

1.4.2 给药干预 造模14 d后进行药物干预。以临床人用药等效剂量为参考，按人与大鼠体表面积系数比确定给药量［2］，各治疗组分别以增液承气汤、大黄水煎液，模型组给予等容积的生理盐水灌胃。药物干预连续7 d。

模型组：上午8点以浓度为10 mg/mL复方地芬诺酯药粉混悬液2 mL灌胃，中午12点灌胃给水3 mL，下午16点灌胃给水2 mL，晚上20点灌胃给水3 mL。总灌胃量10 mL/d。

增液承气汤组（简称增承组）：上午8点以增液承气汤混悬液2 mL灌胃，中午12点灌胃给水3 mL，下午16点以增液承气汤混悬液2 mL灌胃，晚上20点灌胃给水3 mL。总灌胃量10 mL/d。

大黄组：上午8点以大黄混悬液2 mL灌胃，中午12点灌胃给水3 mL，下午16点以大黄混悬液2 mL灌胃，晚上20点灌胃给水3 mL。总灌胃量10 mL/d。

空白组：正常饮食，在4个时间点等量生理盐水灌胃。

1.4.3 大便质地及排便通畅程度分析 观察各组大鼠排便时间、粪便重量、粒数、含水量等，分析各组大鼠排便状态及粪便质地。

1.4.4 肠道传输功能测定 活性炭灌胃法检测大鼠肠道传输功能。具体方法为：大鼠禁食12 h后，以1 mL/l00 g浓度10%活性炭悬液灌胃，记录大鼠首粒黑便的排出时间，以及24 h排黑便粒数，以粪便干湿重比较检测粪便含水率［3］。

1.4.5 肺组织、肠组织病理学观察 药物干预结束后，大鼠禁食12 h，颈椎脱臼处死，开胸取气管与右侧上叶肺组织，以及结肠近盲肠段约2 cm。所取组织生理盐水冲洗，吸干水分，10%中性甲醛固定，脱水，石蜡包埋，切片厚4 μm，二甲苯脱腊。再经各级乙醇水洗：二甲苯 15 min×2次，分别经 100% 乙醇2 min，100% 的乙醇2 min，95%乙醇2 min，75% 乙醇2 min，蒸馏水洗2 min。经苏木素染色5 min，蒸馏水洗1 min，盐酸乙醇分化30 s，蒸馏水浸泡15 min，放置伊红液中2 min，脱水，透明，中性树胶封片；H600透射电子显微镜下病理观察。

1.4.6 酶联免疫法（ELISA）检测肺组织AQP1和AQP3

1.4.6.1 总蛋白的提取 取新鲜100 mg肺组织，剪碎，匀浆，3000 rpm离心15 min，取上清，0.5 mL离心管分装并置于-20℃保存。

1.4.6.2 蛋白含量的测定 1.5 mL离心管加入4℃储存的考马斯亮蓝溶液1 mL。室温放置30 min，空白样品管考马斯亮蓝加0.15 mol/L NaCl溶液100 μL，混匀放置2 min。测试管考马斯亮蓝加5 μL待测蛋白样品和95 μL 0.15 mol/L NaCl溶液，混匀后静置2 min后检测样品。

1.5 统计学方法 所有检测结果以（x±s）表示。组间比较采用单因素方差分析，SPSS 15.0统计软件进行数据分析。

2 结果

2.1 大鼠大便质地及排便通畅程度分析 肉眼可见模型组大便量减少，粪粒干，粒形缩短，排出缓慢费力；增承组和大黄组粪粒数较模型组多，粒形缩短，部分粪便较软。空白组便质及排便状态未见明显变化。

2.2 肠道传输功能测定

2.2.1 对大鼠排便时间及粒数的影响 结果表明，与空白组比较，模型组的首次排便时间显著延长（P<0.01），排便粒数明显减少（P<0.01）；与模型组相比，大黄组首便时间缩短（P<0.05），排便粒数增加无明显统计学意义（P>0.05），增承组首便时间明显缩短（P<0.01），排便粒数增加（P<0.05）。见表1。

表1 4组大鼠排便时间及粒数比较 （x±s）

2.2.2 对大鼠排便重量、粪便含水率的影响 结果表明，与空白组相比，模型组粪便含水率降低（P<0.01），粪便较为干硬；与模型组比，大黄组粪便含水率无统计学意义（P>0.05），增承组粪便含水率增加（P<0.05）。见表2。

表2 4组大鼠含水率比较 （x±s）

2.3 肺、大肠组织病理 肺病理：空白组肺泡均匀，肺间质适中（图1）。模型组肺泡扩张、水肿，肺间质增宽（图2）。增承组肺泡均匀，肺间质增宽，有少量中性粒细胞聚集（图3）。大黄组肺泡扩张，有少量中性粒细胞聚集（图4）。

图1 空白组肺组织（10×10）

图2 模型组肺组织（10×10）

图3 增承组肺组织（10×10）

图4 大黄组肺组织（10×10）

大肠病理：空白组大鼠结肠组织结构正常，绒毛丰富，排列整齐（图5）。模型组肠绒毛变短倒伏，排列不齐，固有层变薄，嗜酸性粒细胞浸润（图6）。增承组可见少量嗜酸性粒细胞（图7）。大黄组结肠固有层内均可见大量嗜酸性粒细胞、淋巴细胞（图8）。

图5 空白组肠组织（10×10）

图6 模型组肠组织（10×10）

图7 增承组肠组织（10×10）

图8 大黄组肠组织（10×10）

2.4 肺组织AQP1和AQP3表达 实验结果显示，与空白组比较，模型组大鼠肺组织AQP1显著降低（P<0.01）；与模型组比较，大黄组肺组织AQP1有升高但无统计学意义（P>0.05），增承组肺组织AQP1升高（P<0.05）。与空白组相比，模型组肠组织AQP3降低（P<0.01）；与模型组比，大黄组肠组织AQP3升高（P<0.05）。增承组肠组织AQP3显著性升高（P<0.01）。见表3。

表3 肺组织水通道蛋白1、蛋白3浓度 （x±s，pg/g）

3 讨论

中医藏象理论认为，肺和大肠相互配合，在津液的生成、输布和排泄中起了重要作用。同时，津液作为精气的重要组成部分，又是维持肺和大肠生理功能正常发挥的基本物质之一。若津液亏虚，则肺失宣肃，累及大肠传导无力，可以引起便秘；若肠道津液亏虚，易从燥化，循经上扰，损伤肺津。由此可见，津液不足是导致肺病及肠、肠病及肺的重要原因。据此，本课题通过限水引起大鼠肠燥津亏，联合复方地芬诺酯灌胃以抑制大鼠肠蠕动，建立复合病因的津亏肠燥大鼠模型，以津液不足引起肠燥津亏、腑气不通，导致肺失宣肃作为切入点，探讨肠病及肺的生物学机制，并分析中药复方“肺肠同治”的生物学基础。

现代医学认为，呼吸道和肺的许多重要功能与体液转运有关。气道的湿化、肺泡液体清除、各种肺损伤引起肺水肿的形成和消散等，都与体液的转运有关。水通道蛋白（apuaporins，AQPS）是由多种组织细胞膜上存在的转运水的特异性通道。作为介导水跨生物膜转运的主要方式之一，AQPS所介导的自由水快速被动的跨生物膜转运，被认为是水进出细胞膜的主要途径，其功能活性对保持细胞内外环境的稳态平衡起重要作用。目前已知的有12种AQPS，且已证实AQPs存在于各级生命中，包括细菌、酵母及植物等。其中AQP1主要表达于支气管黏膜下腺中的上皮细胞，气管腔上皮细胞顶膜面和肺毛细血管内皮细胞，肺泡Ⅱ型上皮细胞也有少量表达［4-5］。尤其是定位于肺泡周围血管内皮的AQP1，对于维持血管与间质之间的水运动平衡意义重大。AQP1敲除的小鼠肺泡毛细血管间水的通透性较野生型的降低10倍，显示AQP1在肺血管通透性中有重要作用。观察大鼠肺组织AQP1变化，将有利于明确津亏肠燥引起肺病的作用机制。

实验中，我们成功构建了津亏肠燥大鼠模型，并以增液承气汤进行干预，观察到在限水和灌服复方地芬诺酯双重因素的影响下，大鼠大便量减少，粪粒干，粒形缩短，首次排便时间延长，排便粒数减少，肺泡充血、水肿，肺组织AQP1降低；与模型组相比，增液承气汤组有减短大鼠首次排便时间、增加排便量，有改善肺组织功能的作用。因此，我们考虑津液亏虚可能是导致病变由肠及肺的主要原因，水通道蛋白-1在肺和大肠津液代谢中起着重要作用，可能是肺与大肠相表里的生物学基础之一。