miRNA-137在膀胱癌中的表达情况及对膀胱癌细胞侵袭和迁移的影响

林学勇，李东

上海市嘉定区安亭医院外科，上海 201805

膀胱癌好发于老年男性，发病率一直居高不下。膀胱癌是世界第四大最常见肿瘤，也是中国最常见的泌尿生殖系统恶性肿瘤，严重影响患者的生命健康[1]。目前，手术治疗仍然是膀胱癌的主要治疗方法，但术后易复发。微小RNA（microRNA，miRNA）是一类含有19～22个核苷酸的内源性非编码RNA，通过诱导目的基因的信使RNA（messenger RNA，mRNA）降解，从而抑制目的蛋白的表达，对原癌基因和抑癌基因均具有调节作用。研究表明，miRNA在肿瘤细胞的增殖、分化和凋亡等基本生物过程中发挥重要作用，胃癌、淋巴瘤、乳腺癌、肺癌、结肠癌和肝癌等恶性肿瘤的发生发展中也可检测到miRNA的突变和异常调节[1-2]。研究显示，miRNA-137可抑制恶性肿瘤的发生发展，其在卵巢癌、胃癌、恶性胶质瘤、结直肠癌和成神经细胞瘤中表达下调[3-5]。Shim izu等[6]研究发现，miRNA-137在膀胱原发性肿瘤中呈甲基化状态，与肿瘤细胞的生物学过程息息相关。本研究探讨miRNA-137在膀胱癌中的表达情况及其对膀胱癌细胞侵袭和迁移能力的影响，现报道如下。

1 材料与方法

1.1 标本收集

选取2015年1月至2017年1月上海市嘉定区安亭医院收治的膀胱癌患者。纳入标准：①术后病理活检证实为膀胱癌；②术前均未接受任何放化疗等其他治疗。排除标准：①合并心、肝、肾等主要器官病变的患者；②膀胱癌复发患者。依据纳入和排除标准，共纳入30例膀胱癌患者，其中男16例，女14例；年龄44～78岁，平均年龄为（64.0±5.7）岁；浸润性膀胱癌12例，非浸润性膀胱癌18例；世界卫生组织（WHO）/国际泌尿病理协会（International Society of Urological Pathology，ISUP）病理分级：Ⅰ级11例，Ⅱ级8例，Ⅲ级7例，Ⅳ级4例。取30例膀胱癌患者的膀胱癌组织和癌旁组织标本，癌旁组织取自膀胱癌患者肿瘤组织＞5 cm处的正常组织。

1.2 实验方法

1.2.1 RT-PCR检测miRNA-137的相对表达量采用实时定量逆转录聚合酶链反应（reverse transcription-polymerase chain reaction，RT-PCR）试剂盒检测膀胱癌组织和癌旁组织中的miRNA-137的相对表达量，Trizol法提取膀胱癌组织和癌旁组织中的总RNA。扩增条件：95℃预变性5 min进入循环，95℃变性45 s，54℃退火45 s，72 ℃延伸1 min，共30个循环，72℃最终延伸5 min。以U6作为内参，2-ΔΔCt法计算miRNA-137的相对表达量。miRNA-137正向引物：5'-GCGCGCTTATTGCTTAAGAATAC-3'，反向引物：5'-CGGCCCAGTGTTCAGACTAC-3'；U 6 正向引物：5'-CTCGCTTCGGCAGCACA-3'，反向引物：5'-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3'。实验重复3次。

1.2.2 细胞转染方法 取本实验室保存的膀胱癌T24细胞株，采用含10%胎牛血清的RPM I 1640培养基，放置于含5%CO2、37℃的细胞培养箱中培养。取对数生长期细胞，以3×105/ml的浓度接种于24孔板，待细胞融合度为70%～80%时，在脂质体LipofectamineTM2000的介导下将m im ic-NC、miRNA-137 m im ic、miRNA-137 inhibitor质粒转染至膀胱癌T24细胞，并分别作为空白组、高表达组和低表达组，转染48 h后，RT-PCR法检测各组细胞miRNA-137的相对表达量。实验重复3次。

1.2.3 Transwell小室检测细胞的迁移和侵袭能力将基质胶加入到24孔的Transwell小室中，加入驱化剂。取空白组、过表达组和低表达组的细胞加入Transwell小室，培养24 h后取出，擦除没有穿膜的细胞。采用0.1%的结晶紫对通过小室滤膜的细胞进行染色，再漂洗、固定，在显微镜下随机选取5个视野计数3组膀胱癌T24细胞的迁移和侵袭数目。实验重复3次。

1.3 统计学方法

采用SPSS 20.0软件对数据进行统计分析。正态分布计量资料以均数±标准差（±s）表示，两组间比较采用两独立样本t检验，多组间比较采用单因素方差分析，多组间两两比较采用LSD-t检验；相关分析采用Spearman相关分析。以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 膀胱癌组织和癌旁组织中miRNA-137相对表达量的比较

浸润性膀胱癌组织中miRNA-137的相对表达量为（2.87±0.21），明显高于非浸润性膀胱癌组织的（1.12±0.19）和癌旁组织的（1.00±0.13），差异均有统计学意义（t=33.85、41.47，P＜0.01）；但非浸润性膀胱癌组织和癌旁组织中miRNA-137的相对表达量比较，差异无统计学意义（P＞0.05）。

2.2 膀胱癌组织中miRNA-137的相对表达量与膀胱癌患者病理分级的关系

病理分级为Ⅳ级的膀胱癌患者膀胱癌组织中miRNA-137的相对表达量均明显高于病理分级为Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ级的患者，差异均有统计学意义（t=8.16、14.91、22.30，P＜0.01）（表1）。Spearman相关分析显示，miRNA-137的相对表达量与膀胱癌患者病理分级呈明显正相关（r=6.528，P＜0.01）。

表1 不同病理分级膀-胱癌患者膀胱癌组织中miRNA-137的相对表达量（±s）

表1 不同病理分级膀-胱癌患者膀胱癌组织中miRNA-137的相对表达量（±s）

病理分级Ⅰ（n=11）Ⅱ（n=8）Ⅲ（n=7）Ⅳ（n=4）1.326±0.14 1.942±0.19 2.617±0.23 3.582±0.29 miRNA-137的相对表达量

2.3 过表达组、空白组和低表达组膀胱癌T24细胞中miRNA-137相对表达量的比较

将过表达组、空白组和低表达组膀胱癌T24细胞转染48 h后，RT-PCR法检测3组细胞miRNA-137的相对表达量，结果显示，过表达组细胞miRNA-137的相对表达量为（5.65±0.36），明显高于空白组的（2.26±0.13），差异有统计学意义（t=48.51，P＜0.01）；且低表达组细胞miRNA-137的相对表达量为（0.43±0.02），明显低于空白组细胞，差异有统计学意义（t=76.21，P＜0.01）。

2.4 过表达组、空白组和低表达组膀胱癌T24细胞侵袭能力的比较

采用Transwell小室检测3组迁移和侵袭细胞数目，结果显示，过表达组迁移和侵袭细胞数目均高于空白组细胞，差异均有统计学意义（P＜0.05）；低表达组迁移和侵袭细胞数目均低于空白组细胞，差异均有统计学意义（P＜0.05）。（表2）

表2 过表达组、空白组和-低表达组膀胱癌T24细胞迁移和侵袭数目的比较（±s）

表2 过表达组、空白组和-低表达组膀胱癌T24细胞迁移和侵袭数目的比较（±s）

注：*与空白组比较，P<0.05

组别低表达组空白组过表达组迁移细胞数102±13*166±21 241±28*侵袭细胞数63±9*119±16 202±19*

3 讨论

目前，手术切除仍然是膀胱癌的主要治疗手段，但术后复发率较高，预后较差[7-8]。早诊断、早治疗可明显提高膀胱癌患者的生存率，有效避免局部复发和远处转移，是改善膀胱癌患者预后的关键。研究显示，miRNA可在多种恶性肿瘤的发生发展过程中发挥调节作用[9-11]。

miRNA-137最早是在胃癌、恶性胶质瘤和乳腺癌中发现，随后，卵巢癌、肺癌、直肠癌和神经胶质瘤中亦发现miRNA-137具有抑制肿瘤发生发展的作用，但具体的作用机制仍不明确[12-14]。Shimizu等[6]研究结果显示，膀胱癌患者肿瘤组织中可检测到miRNA-137的表达，且miRNA-137大多以甲基化形式存在，并存在异位表达，但仍需进一步探讨miRNA-137在膀胱癌中的具体作用机制。本研究采用RT-PCR法检测膀胱癌组织和癌旁组织中miRNA-137的相对表达量，结果显示，浸润性膀胱癌组织中miRNA-137的相对表达量明显高于非浸润性膀胱癌组织，表明miRNA-137可能与膀胱癌的侵袭和迁移有关。本研究比较不同病理分级膀胱癌患者的膀胱癌组织中miRNA-137的相对表达量，并进行Spearman相关分析，结果显示，病理分级为Ⅳ级的膀胱癌患者miRNA-137的相对表达量最高，且miRNA-137的相对表达量与膀胱癌患者病理分级呈明显正相关，表明miRNA-137的表达可能与膀胱癌的发生发展有关。此外，过表达组、空白组和低表达组膀胱癌T24细胞的迁移和侵袭细胞数目均高于空白组细胞，而低表达组迁移和侵袭细胞数目均低于空白对照组细胞，表明miRNA-137的相对表达量可能与膀胱癌细胞的侵袭和迁移能力有关，miRNA-137表达上调可以提高膀胱癌细胞的侵袭和迁移能力，抑制miRNA-137的表达可以抑制膀胱癌细胞的侵袭和迁移能力。

综上所述，浸润性膀胱癌组织和病理分级为Ⅳ级的膀胱癌组织中miRNA-137的相对表达量较高，上调miRNA-137的表达可以促进膀胱癌细胞侵袭和迁移能力，抑制其表达可以抑制膀胱癌细胞的侵袭和迁移能力。