双酚A激活PI3K/AKT通路促进子宫内膜癌细胞增殖的研究

刘大江，杨媛，刘畅，杨永秀

子宫内膜癌是女性最常见的妇科恶性肿瘤，国内外的发病率逐年升高，且呈年轻化趋势[1-2]。根据临床病理特征和分子生物学改变分为雌激素依赖型和非雌激素依赖型，其中雌激素依赖型子宫内膜癌约占90%，目前认为肥胖、糖尿病、内分泌紊乱及持续雌激素刺激是雌激素依赖型子宫内膜癌的高危因素[3]。磷脂酰肌醇3激酶/蛋白激酶B（PI3K/AKT）通路激活常见于雌激素依赖型子宫内膜癌，PI3K激活后在质膜上产生第二信使磷脂酰肌醇三磷酸（PIP3），PIP3与细胞内含有PH结构域的信号蛋白AKT和磷酸肌醇依赖型激酶 1（phosphoinositide dependent kinase-1，PDK1）结合，使PDK1磷酸化AKT蛋白的Ser308，活化AKT。该通路的活化可促进细胞异常生长，诱导细胞癌变。

很多疾病（肿瘤、炎症及代谢性疾病等）都与环境因素关系密切。一些环境污染物可与雌激素受体结合或影响细胞信号通路发挥类似雌激素的效应，诱发肿瘤细胞的恶性增殖。双酚A（bisphenol A，BPA）是一类常见的环境内分泌干扰物，与雌激素的化学结构相似，有显著的类雌激素作用，可经口、呼吸道、皮肤等多种途径被人体摄入[4]。BPA被用来合成聚碳酸酯塑料和环氧树脂，存在于塑料、农药、药物、洗涤剂和化妆品等数千种消费品中。

目前研究表明，BPA可促进乳腺癌、前列腺癌和卵巢癌的发生，Bergeron等[5]认为BPA在人子宫内膜癌细胞系中可表现出类雌激素作用，并通过改变基因的表达，影响雌激素依赖型子宫内膜癌细胞的增殖。Wang等[6]发现，BPA具有诱导子宫内膜癌细胞系（RL952）上皮-间质转化的作用，增强其迁移能力。但BPA促进雌激素依赖型子宫内膜癌细胞发生的机制尚不清楚。现就BPA促进子宫内膜癌发生机制进行深入研究。

1 材料与方法

1.1 细胞培养人雌激素受体阳性的子宫内膜癌Ishikawa和RL952细胞株（本实验室冻存）常规培养于37℃5%CO2培养箱中，培养基为含有10%胎牛血清（FBS）的无酚红DMEM/F12。BPA购于美国Sigma公司，溶于二甲基亚砜（DMSO）中，配制浓度为10 mol/L的BPA母液，-20℃保存。

1.2 CCK8法检测BPA对子宫内膜癌细胞的促增殖作用取对数生长期未做处理的Ishikawa和RL952细胞，用含有10%FBS的无酚红DMEM/F12分别制成单细胞悬液，细胞浓度约为5×105/mL，每孔100 μL，将两种细胞的单细胞悬液分别接至96孔板，待细胞培养至贴壁后，每个96孔板中分别设实验组（依次加入浓度为 0.1 nmol/L，1 nmol/L，10 nmol/L，100 nmol/L，1 μmol/L，10 μmol/L，100 μmol/L 的 BPA 药液 10 μL）、对照组（加入含 0.1%DMSO 培养液 10 μL），于 24、48、72 h 后每孔加入10 μL CCK-8（设置5个复孔），原条件下继续培养4 h。之后置于酶标仪490 nm波长下检测2种细胞吸光度值（OD值），实验重复3次。制作细胞生长曲线。CCK8检测细胞增殖的原理：该试剂中含有WST-8，其在电子载体（1-Methoxy PMS）的作用下被细胞线粒体中的脱氢酶还原为具有高度水溶性的黄色甲瓒染料，生成的甲瓒物的数量与活细胞的数量成正比，因此，用这一特性检测细胞增殖，OD值越高，细胞增殖力越强。

1.3 蛋白质印迹（Western blotting）法检测蛋白表达量在Ishikawa和RL952细胞中，加入DMSO为对照组，1 μmol/L BPA处理48 h后为实验组，同时加入1 μmol/L BPA和PI3K抑制剂（LY294002，购于美国 Sigma公司，10 μmol/L 为工作浓度）为抑制剂组，提取上述3组细胞中蛋白，每孔25 μg上样，行聚丙烯酰胺凝胶电泳，电转移至硝酸纤维素膜，孵一抗4℃过夜，p-AKT、AKT及β-actin抗体购于美国Santa Cruz公司。辣根过氧化物酶标记二抗，化学荧光发光法显影（碧云天公司）。操作过程按说明书进行。灰度扫描，用Image J计算灰度值，以灰度值表示蛋白表达量。

1.4 统计学方法采用Graphpad prism 5和SPSS 16.0进行统计分析，定量资料正态分布的数据用均数±标准差（±s）表示，多组间比较用单因素方差分析，组间两两比较用LSD-t检验，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 BPA对子宫内膜癌细胞增殖的影响不同浓度的BPA作用24 h后未对Ishikawa细胞产生明确的促细胞生长效应（P=0.535）。不同浓度的BPA作用48 h后，当BPA浓度≤1 μmol/L时，Ishikawa细胞的增殖呈现浓度依赖性（F=2.316，P=0.004），BPA 浓度越高，促细胞生长效果越显著。1 μmol/L BPA促细胞增殖的效应最显著，细胞增殖率为0.758±0.023，当BPA浓度大于1 μmol/L时，细胞增殖率呈降低趋势。不同浓度的BPA作用72h后，Ishikawa细胞无明显增殖趋势（F=1.483，P=0.942）。上述结果在RL952细胞中相似，见表1。

表1 子宫内膜癌Ishikawa和RL952细胞在不同浓度及作用时间的BPA下的OD值 （±s）

表1 子宫内膜癌Ishikawa和RL952细胞在不同浓度及作用时间的BPA下的OD值 （±s）

组别 n 24 h 48 h 72 h F（P）Ishikawa细胞对照组 3 0.226±0.094 0.335±0.074 0.352±0.092 1.324（0.932）0.1 nmol/L 3 0.229±0.037 0.345±0.025 0.213±0.021 1.812（0.004）1 nmol/L 3 0.248±0.063 0.492±0.028 0.244±0.016 1.995（0.000）10 nmol/L 3 0.252±0.018 0.592±0.019 0.248±0.023 2.036（0.000）100 nmol/L 3 0.255±0.027 0.611±0.036 0.221±0.063 2.146（0.000）1 μmol/L 3 0.269±0.066 0.758±0.023 0.242±0.028 2.305（0.000）10 μmol/L 3 0.267±0.076 0.667±0.036 0.201±0.028 2.117（0.000）100 μmol/L 3 0.269±0.065 0.719±0.028 0.249±0.025 1.983（0.000）F（P） 1.242（0.535） 2.316（0.004） 1.483（0.942）组别 n 24 h 48 h 72 h F（P）RL952细胞对照组 3 0.253±0.026 0.356±0.043 0.362±0.052 1.228（1.012）0.1 nmol/L 3 0.232±0.018 0.342±0.015 0.224±0.015 1.643（0.009）1 nmol/L 3 0.246±0.023 0.454±0.031 0.262±0.030 1.884（0.000）10 nmol/L 3 0.253±0.022 0.578±0.024 0.268±0.016 1.971（0.000）100 nmol/L 3 0.261±0.034 0.593±0.018 0.259±0.056 2.093（0.000）1 μmol/L 3 0.274±0.022 0.692±0.042 0.267±0.012 2.332（0.000）10 μmol/L 3 0.282±0.026 0.654±0.011 0.258±0.024 1.984（0.000）100 μmol/L 3 0.288±0.017 0.699±0.035 0.260±0.011 1.973（0.000）F（P） 1.195（0.692） 2.632（0.002） 1.390（0.818）

2.2 BPA作用子宫内膜癌细胞后，激活PI3K/AKT通路Western blotting检测3组中p-AKT和AKT蛋白表达，见图1。在Ishikawa细胞中，实验组p-AKT蛋白表达水平高于对照组（P＜0.05）。抑制剂组p-AKT蛋白表达水平低于实验组（P＜0.05），但与对照组比较差异无统计学意义（P＞0.05），见表2。上述结果在RL952细胞中相似。

图1 BPA对子宫内膜癌Ishikawa和RL952细胞中p-AKT蛋白表达的影响

表2 BPA作用后子宫内膜癌Ishikawa和RL952细胞中p-AKT蛋白相对表达量

3 讨论

BPA参与前列腺癌、神经母细胞瘤、乳腺癌及卵巢癌等实体瘤的发生、发展[7-10]。雌激素依赖型子宫内膜癌是雌激素相关性肿瘤，目前有关BPA与子宫内膜癌发生、发展的相关研究较少，BPA在子宫内膜癌中具有类雌激素样作用，但具体如何调控子宫内膜癌的增殖，尚不明确。本研究发现，BPA可促进雌激素受体阳性的子宫内膜癌细胞株Ishikawa和RL952细胞的增殖，且呈现出一定的时间和浓度梯度，即当BPA浓度为1 μmol/L作用48 h时，Ishikawa和RL952细胞的增殖率最高，随着BPA浓度的增高，表现出细胞毒性作用。与Bergeron等[5]研究结果一致，BPA可促进子宫内膜癌细胞的增殖，但其机制不得而知。

PI3K/AKT信号通路是子宫内膜癌异常活化的信号通路，控制体内细胞生长、增殖和存活细胞代谢和自噬[11]。PI3K调控下游AKT靶蛋白，AKT信号调控细胞增殖和存活、细胞生长、葡萄糖代谢、细胞运动和血管生成，在正常细胞生理和各种疾病状态中都发挥重要作用[12]。本研究中，1 μmol/L BPA作用Ishikawa和RL952细胞48 h后，BPA有显著的促增殖效应，在处理72 h后，BPA不对Ishikawa细胞表现出促增殖效应。推断此时BPA对Ishikawa细胞产生了毒性作用，促进细胞死亡，使BPA作用48 h的促增殖作用得到抵消。Western blotting发现，实验组p-AKT蛋白表达水平高于对照组（P＜0.05）。抑制剂组p-AKT蛋白表达水平低于对照组和实验组，但与对照组比较差异无统计学意义，与实验组比较差异有统计学意义（P＜0.05）。表明BPA可能通过激活PI3K/AKT通路促进子宫内膜癌细胞Ishikawa和RL952的增殖，阻断该通路，BPA则无法激活PI3K/AKT通路。

BPA具有显著的雌激素活性，通过激活PI3K/AKT信号通路参与雌激素依赖型子宫内膜癌的发生、发展，但BPA通过何途径激活下游信号，具体机制值得进一步研究，为明确和完善雌激素型子宫内膜癌的发病机制及治疗提供理论依据。