孕期锌缺乏对大鼠胎心GATA4和Nkx2.5基因启动子区甲基化和组蛋白乙酰化水平的影响

刘超斌，洪新如，张群芳，谢熙，王勍，林顺和，王真红，孙庆华

先天性心脏病（congenital heart diseases，CHD）是由胚胎期心脏、血管发育障碍所致的心脏血管结构、功能及代谢的异常，在活产婴儿中的发病率可达26‰，位居监测的出生缺陷首位[1]。CHD病因未明，多数CHD与环境因素密切相关，其中妊娠期母体条件，特别是营养物质供给状况对胎儿的发育起重要作用。在众多营养素中，微量元素锌是胎儿发育的必需营养素之一，在胎儿发育中起重要作用[2]。世界卫生组织（WHO）推荐孕妇锌摄入量每日不低于20 mg[3]。虽然我国孕期保健水平已有了很大提高，但由于孕期吸收降低、流失增加、生理需求量增加以及部分孕妇锌摄入不足等原因，我国孕妇孕期锌缺乏状况仍较为普遍，近年的调查显示我国部分地区孕妇锌缺乏的发生率达7.4%[4]。因此，孕期锌缺乏及由此引发的相关疾病和不良健康状况仍是我国较为突出的公共健康问题。

临床观察和实验研究均提示，孕期锌缺乏与CHD的发病密切相关[5]，然而，锌缺乏影响胎心发育的作用环节和机制尚未阐明。近年表观遗传学机制在环境影响个体发育的研究中受到高度的重视。表观遗传修饰包括基因的甲基化和组蛋白修饰等，对基因表达有调控作用，并受环境、应激等因素影响。外部不良环境因素，如环境毒物、微量元素缺乏、应激等可改变表观遗传修饰的模式或强度，引发疾病的发生。DNA甲基化异常与许多疾病的发生、发展关系密切，其中包括心血管系统发育异常[6]。然而，目前尚不清楚表观遗传机制如何在孕期锌缺乏影响胎鼠心脏发育中起作用[7]。

GATA结合因子4（GATA4）和Nk2型同源盒转录因子5（Nkx2.5）均为与胎心发育密切相关的关键性转录因子，其间存在相互作用，并与其他调节基因共同调控下游基因的表达，促进心肌细胞的正常分化[8]。GATA4和Nkx2.5的表达水平和表观遗传修饰的改变均可导致胎心发育异常[9]，而GATA4和Nkx2.5的表观遗传修饰机制是否也参与孕期锌缺乏对胎心发育的不良效应尚不清楚。本研究通过大鼠孕期锌缺乏模型，观察其对胎心发育关键性转录因子GATA4和Nkx2.5的基因启动子区胞嘧啶-磷酸-鸟嘌呤（CpG）岛甲基化和组蛋白H3K9乙酰化水平的影响，旨在从表观遗传学的角度初步探讨孕期锌缺乏影响胎心发育的机制。

1 材料与方法

1.1 实验材料实验动物为SPF级10周龄的雌性SD大鼠27 只[体质量（222±13）g]和雄性大鼠 14 只用于交配，均购自上海斯莱克实验动物公司（动物合格证号：SCXK[沪]2016-0002）。大鼠饲养于SPF级环境，室温22～24℃、相对湿度50%～60%，光照时间昼夜交替（12 h/12 h）。主要试剂与仪器包括：DNA提取试剂盒（美国Qiagen公司）；DNA甲基化修饰试剂盒（美国Sigma公司）；染色质免疫共沉淀（CHIP）检测试剂盒（美国Abcam公司）；BH5100plus多通道光谱分析仪（北京博晖创新光电技术股份有限公司）；TAS-986型原子吸收分光光度计（北京普析通用仪器有限公司）；实时定量聚合酶链反应（PCR）扩增仪（美国ABI公司）；凝胶电泳系统（北京六一仪器厂公司）；自动凝胶成像分析系统（美国Bio-Rad公司）；低温冰箱和台式离心机（美国Thermo Fisher公司）；电子称（上海舜宇恒平公司）等。

1.2 饲料配制缺锌组饲料的配制参照文献[10]，成分见表1。除锌含量不同外，足锌饲料和缺锌饲料的其他成分相同。以电子称（精确到1 mg）量取各成分配齐，并委托福建省闽科饲料有限公司按照SPF级饲料的生产标准制作。从配制好的饲料中随机取样，按4∶1比例置于HNO3和HClO4混合液中过夜，加热至淡黄色澄清溶液为止。以光谱分析仪测定锌元素的吸光度，计算饲料中元素锌的含量，缺锌饲料、足锌饲料中含锌量分别为 2.8 μg/kg 和 29.8 μg/kg。

表1 缺锌饲料的组成成分

1.3 动物分组和大鼠孕期缺锌模型的制备参照Lopez等[11]方法，将大鼠随机分为缺锌组（摄入缺锌饲料，n=9）、足锌组和配饲组（均摄入足锌饲料，n=9）。其中配饲组的摄入量按前1 d缺锌组的摄食量投放，使2组摄入量接近以消除或降低因摄入量差异带来的影响；足锌组摄食量不限。饮水为去离子水，量不限。大鼠置于塑料笼中单笼饲养，笼子、饮水瓶在使用前用去离子水处理，减少锌元素的污染。饲养14 d后雌雄鼠按2∶1同笼交配，以次晨查及阴栓者为受孕，该日为孕0 d（未受孕者继续合笼交配至受孕，本组雌鼠均在2 d内受孕），同法继续喂养至孕19 d后进入后续实验。

1.4 标本采集和预处理各组孕鼠腹腔注射10%水合氯醛（3～5 mL/kg）麻醉，剖取胎鼠，行胎鼠心内穿刺获取全血。将血标本置于乙二胺四乙酸二钠（EDTANa2）预处理的抗凝管中，每窝胎鼠的血标本合并后充分混匀，作为1份样本。分离胎心，生理盐水漂洗，灭菌滤纸吸除残血和残留组织。来自同窝的胎心标本混合成1份样本，剪碎，取部分心肌组织用于锌含量检测。其余心肌组织充分匀浆，用于心脏转录因子基因的检测。

1.5 胎鼠全血和心肌组织的锌水平检测胎鼠血锌水平采用微机自动控制的光谱分析仪检测，以吸收度对浓度进行线性回归并计算相关系数，锌回归方程为锌浓度=1.818×吸收度，相关系数r=0.994。通过测定待测样品的特征辐射吸收度自动计算样品锌元素的含量。胎鼠心肌组织锌元素含量采用原子吸收分光光度法。心肌组织用去离子水漂洗，吸干称量湿重，置于硫酸纸上烘干称量干重。烘干组织块置于3 mL HNO3和HClO4（1∶4）混合液中消化后加去离子水至2 mL，检测吸光度，通过配置的自动分析软件计算样品中的锌元素浓度。

1.6 GATA4和Nkx2.5基因启动子区CpG岛甲基化水平检测按照DNA提取试剂盒的操作步骤提取心肌组织DNA，采用紫外分光光度法检测样品DNA浓度后置于-20℃保存。采用亚硫酸氢盐修饰样品DNA，使解旋后双链DNA未甲基化胞嘧啶转换成尿嘧啶，依照试剂盒操作说明加入亚硫酸盐试剂孵育，4℃避光保存。经洗涤、去亚硫酸盐反应获得处理后基因组DNA。根据样品浓度，各组DNA样品的上样量均为330 ng、上样体积20 μL，体积不足者以无菌双蒸水补足。采用甲基化特异性PCR法检测GATA4和Nkx2.5基因启动子区CpG岛的甲基化水平[12]。GATA4和Nkx2.5基因的甲基化特异性PCR引物采用MethPrimer软件设计。引物序列和扩增片段长度见表2。

表2 甲基化特异性PCR及CHIP实时定量PCR引物序列和扩增片段长度

GATA4基因的甲基化特异性PCR扩增反应体系为DNA模板 1 μL、TaqDNA 聚合酶 0.25 μL、10×PCR 缓冲液 5 μL、dNTP 4 μL、上下游引物各 1 μL，加双蒸水至 50 μL；反应条件为94℃预变性5 min后94℃变性30 s，68℃（甲基化）或64℃（非甲基化）退火45 s，72℃延伸45 s，共30个循环后72℃延伸7 min。Nkx2.5基因的甲基化特异性PCR扩增反应体系为DNA模板 3 μL、PCR聚合酶预混液5 μL、上下游引物各0.5 μL、双蒸水1 μL；反应条件为95℃预变性 7 min后 95℃变性30 s，62℃退火30 s，72℃延伸10 s，共36个循环后72℃延伸10 min。PCR反应完毕后，分别取8 μL扩增产物于2%琼脂糖凝胶电泳，通过自动凝胶成像系统行图像分析。

1.7 GATA4和Nkx2.5基因启动子区CpG岛组蛋白H3K9乙酰化水平检测采用CHIP实时定量PCR法检测，按试剂盒的操作说明书步骤实施。取各组心肌组织样本，加入1%甲醛行交联反应。超声破碎仪切割DNA，产物经琼脂糖凝胶电泳得其长度为220～1 100 bp。基于基因启动子区CpG岛结构分别设计CHIP引物，其序列见表2。蛋白-DNA复合物经乙酰化H3K9抗体等免疫沉淀反应，经沉淀、清洗、逆交联和纯化后获得DNA样品。扩增反应的条件为94℃预变性10 min后 94 ℃变性 20 s，60 ℃退火 1 min，共 50 个循环。以 2-ΔΔCt值作为基因表达量的结果进行比较。

1.8 统计学方法采用SPSS 17.0软件进行数据分析。定量资料用均数±标准差（±s）表示，多组间比较采用单因素方差分析，进一步的两两比较采用LSD-t法。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 各组胎鼠血锌和心肌组织的锌水平3组胎鼠血锌水平差异有统计学意义（P＜0.05），其中缺锌组显著低于足锌组（P＜0.001）和配饲组（P=0.014），配饲组与足锌组比较差异无统计学意义（P=0.109）。3组胎鼠心肌组织锌水平差异无统计学意义（P＞0.05）。见表 3。

表3 各组胎鼠血锌和心肌组织锌水平比较（±s）

表3 各组胎鼠血锌和心肌组织锌水平比较（±s）

注：*与缺锌组比较，P＜0.05。

组别 n 血锌水平（μg/mL） 心肌组织锌水平（μg/g）缺锌组 9 4.41±0.55 0.57±0.19足锌组 9 5.73±0.62* 0.89±0.30配饲组 9 5.22±0.76* 0.84±0.35 F 9.461 3.218 P 0.001 0.058

2.2 基因启动子区CpG岛甲基化水平心肌标本提取DNA的OD值为1.81，符合实验要求。结果显示，3组胎鼠GATA4和Nkx2.5基因启动子CpG岛甲基化水平差异有统计学意义（P＜0.05），其中缺锌组较足锌组（P=0.005；P=0.024）和配饲组（P＜0.001；P=0.029）显著升高，配饲组与足锌组比较差异无统计学意义（P=0.497；P=0.929）。见图 1、表 4。

图1 GATA4和Nkx2.5基因启动子区CpG岛甲基化水平PCR电泳条带图

2.3 基因启动子区CpG岛乙酰化水平3组胎鼠GATA4和Nkx2.5基因启动子CpG岛组蛋白H3K9乙酰化水平差异有统计学意义（P＜0.05），其中缺锌组较足锌组（P=0.018；P=0.033）和配饲组（P=0.007；P=0.007）显著降低，配饲组与足锌组比较差异无统计学意义（P=0.701；P=0.512），见表 5。

表4 各组GATA4和Nkx2.5基因启动子区CpG岛甲基化水平比较 （±s）

表4 各组GATA4和Nkx2.5基因启动子区CpG岛甲基化水平比较 （±s）

注：*与缺锌组比较，P＜0.05。

组别 n GATA4 Nkx2.5缺锌组 9 22.34±4.62 13.44±3.73足锌组 9 16.56±3.74* 9.68±2.99*配饲组 9 15.27±3.45* 9.82±3.14*F 8.103 3.750 P 0.002 0.038

表5 各组GATA4和Nkx2.5基因启动子区CpG岛乙酰化水平比较 （±s）

表5 各组GATA4和Nkx2.5基因启动子区CpG岛乙酰化水平比较 （±s）

注：*与缺锌组比较，P＜0.05。

组别 n GATA4 Nkx2.5缺锌组 9 4.43±1.95 3.17±1.33足锌组 9 6.59±1.81* 4.94±1.86*配饲组 9 6.92±1.64* 5.46±1.74*F 5.056 4.713 P 0.015 0.019

3 讨论

微量元素锌在胎心的正常发育中起重要作用[13]。孕鼠中、重度锌缺乏时母体无法从组织中动员足量的锌来满足子代正常发育的需要，可导致胎心畸形等发育异常[14-15]。GATA4和Nkx2.5为胎儿期心脏发育的关键性转录因子。本研究结果表明，孕期锌缺乏使GATA4和Nkx2.5基因启动子的甲基化水平和组蛋白乙酰化水平均发生改变，提示孕期母体锌缺乏可能通过GATA4和Nkx2.5基因表观遗传学修饰的改变影响胎心的正常发育。

胎心发育是一个精密而复杂的过程，其细胞的分化和增殖受遗传-表观遗传修饰调控网络的调节。GATA4和Nkx2.5在胎心发育不同阶段的激活和表达有严格的时-空顺序性，这种时序性很大程度上是由基因的表观遗传修饰所决定的[16]，其中DNA甲基化起重要作用，尤以启动子CpG岛甲基化为其主要的修饰方式之一[17]。基因组和特定基因的DNA甲基化水平与胎儿期心血管系统的发育及心血管疾病有密切关系。另一方面，与基因启动子相结合的组蛋白可通过乙酰化/去乙酰化改变核小体和染色质的空间结构，使其与转录复合物的结合能力发生变化，从而影响基因的表达水平[18]。本研究通过低锌饲料喂养建立大鼠孕期锌缺乏模型，结果显示胎鼠循环血液中的锌水平显著降低，心肌组织锌水平也呈下降趋势，提示胎鼠存在锌缺乏状况。胎心组织GATA4和Nkx2.5基因均出现显著的表观遗传学修饰变化，缺锌组GATA4和Nkx2.5基因启动子CpG岛甲基化水平较足锌组和配饲组显著升高，其相对值分别为足锌组的1.35、1.39倍和配饲组的1.46、1.37倍；而启动子组蛋白H3K9的乙酰化水平则较足锌组和配饲组显著降低，分别为足锌组的67.22%、64.17%和配饲组的64.02%、58.06%，提示这2个转录因子表观遗传改变中均包括了基因启动子甲基化、组蛋白乙酰化水平的变化。由于配饲组和足锌组比较启动子甲基化和组蛋白H3K9乙酰化水平差异无统计学意义，因而排除了缺锌导致饲料摄入量变化影响GATA4和Nkx2.5基因表观遗传学相关指标的可能性。

基因表观遗传修饰的改变对基因表达和功能有显著影响。香烟烟雾暴露或尼古丁暴露实验中，均观察到由于GATA4基因甲基化增强而使其表达减弱，使心肌的正常分化受到影响[19]；而咖啡因宫内暴露则通过胎心细胞GATA4等调节基因的甲基化水平降低影响其表达的水平[20]。临床观察也显示GATA4高甲基化见于临床单独心脏畸形或联合其他畸形的胎儿[21]。另有研究表明，乙醇暴露使GATA4、Nkx2.5等心脏调控基因组蛋白H3K9乙酰化水平升高，使GATA4[22]、Nkx2.5[23]表达升高，与胎儿先天性心脏病的发病密切相关[24]；体外培养的新生小鼠心肌细胞GATA4启动子区组蛋白H3乙酰化修饰水平降低则可显著下调GATA4 mRNA的表达[25]。本研究观察到孕期锌缺乏使胎鼠心肌GATA4和Nkx2.5的基因启动子CpG岛甲基化水平升高、组蛋白H3K9乙酰化水平降低，结合本文笔者所在课题组前期研究观察到的孕期锌缺乏使胎鼠心肌GATA4 mRNA和Nkx2.5 mRNA表达显著下调，以及心肌组织病理变化、氧化应激和炎性指标的异常改变[26]，可以推知，孕期锌缺乏导致的胎心GATA4和Nkx2.5基因表观遗传学修饰改变影响了这2个关键基因的正常表达，是孕期锌缺乏导致胎心发育异常的重要因素之一。虽然有研究显示GATA4的表达受其启动子甲基化-乙酰化水平的共同调节，Nkx2.5的表达以其启动子乙酰化调控为主，甲基化的调节作用较弱[27]。

GATA4和Nkx2.5彼此互为辅助因子，在调控网络中通过相互作用共同调控下游基因的表达，维持胎心正常发育[28]。GATA4基因上有Nkx2.5的结合位点，为GATA4启动子特异性表达所必需；Nkx2.5基因启动子中有2个特异性GATA结合区，也是早期胎心发育所必需的，在心室肌细胞其可调控GATA4的表达[29]。GATA4通过其羟基端锌指与依赖Nkx2.5的转录激活结构域相结合，激活下游基因的表达[30]；通过环磷酸腺苷（cAMP）反应元件结合蛋白与Nkx2.5产生间接作用，调控基因的转录。因此在表观遗传学修饰的层面上，GATA4和Nkx2.5互为调控、互相影响。本研究在孕期母体锌缺乏模型上观察到的GATA4和Nkx2.5表观遗传学变化亦是密切关联的，在功能上的联系可能更为紧密，其具体的内在联系和作用环节有待进一步研究。

本研究工作存在一定局限性，可能增加了研究结果的不确定性。饲料中锌以外的其他营养素是否充足、是否对胎心发育产生影响未予评估；其他胎心发育相关的调节因子，如同源盒基因5（TBX5）、配对盒基因（PAX8）等未纳入观察；表观遗传修饰的类型较多，本研究只观察了基因甲基化和组蛋白乙酰化修饰的情况，而未观察其他类型修饰，如磷酸化修饰、小片段RNA修饰、小片段泛素相关修饰等的情况。尽管如此，本研究从心脏发育关键调控基因表观遗传修饰的角度，探讨了孕期锌缺乏对胎鼠心脏发育不良效应的表观遗传学机制的参与及其可能的效应，为进一步深入研究孕期锌缺乏与胎鼠心脏发育异常的关系提供了有益线索。