Notch信号通路通过ATF5调控脊髓神经干祖细胞分化

秦 杰,赵立晶,董 晖,王 丹,杨一亭,赵 波,贺西京,李浩鹏,王 栋*

(1 西安交通大学第二附属医院骨二科,西安 710004;2 陕西省定边县人民医院骨伤科;3 西安交通大学第二附属医院手术麻醉科;*通讯作者,E-mail:wado110@163.com)

脊髓损伤是骨科和神经外科常见疾病,会导致神经细胞死亡和上下行传导束中断,多种炎性因子进入损伤区,血脑屏障破坏,局部微环境失衡,触发细胞坏死及凋亡等级联反应。由于受损局部微环境的异常,导致多种神经生长抑制性因子表达于神经干细胞表面,促进脊髓内神经干/祖细胞(spinal cord neural stem/progenitor cells,spNSPCs)向星形胶质细胞分化,形成胶质瘢痕,分泌轴突再生抑制因子,抑制神经细胞和轴突再生[1]。spNSPCs分化涉及复杂的精确调控的过程,受到多条途径的共同作用。Notch信号通路是一个在进化上十分保守的跨膜蛋白家族,主要介导分化抑制信号,在神经系统的发生发育上起着重要作用[2],参与控制神经干细胞的扩增及决定其最终分化命运。研究spNSPCs分化调控的分子机制,如何促进spNSPCs向神经元和少突胶质细胞分化,减少其向星形胶质细胞分化,对spNSPCs的临床应用及神经系统疾病治疗具有重要的意义。转录激活因子5(activating transcription factor 5,ATF5)是转录激活因子/cAMP反应元件(CREB)结合蛋白家族成员,在细胞发育、分化、增殖和凋亡中扮演着多种重要作用[3]。因此,本研究将探讨ATF5在Notch信号通路调控spNSPCs分化中的作用。

1 材料与方法

1.1 实验动物与主要试剂

在获得西安交通大学实验动物伦理委员会批准后,实验用SPF级8周龄C56BL/6J小鼠购于西安交通大学实验动物中心,体质量18-22 g,动物生产许可编号:SCXK(陕)2018-001。胰酶、DMEM/F12、B27、N2、GlutaMAX、胎牛血清(FBS)购于美国Gibco公司,表皮细胞生长因子(EGF)和碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)购于美国Peprotech公司,Accutase细胞消化分离液、多聚赖氨酸(Poly-L-Lysine)、层粘连蛋白(Laminin)、多聚甲醛(PFA),磷酸缓冲盐溶液(PBS)、Triton X-100、牛血清白蛋白(BSA)、3,5-二氟苯乙酰基-L-丙氨酰基-L-2-苯基甘氨酸叔丁酯(N-[N-(3,5-Difluorophenacetyl)-L-alanyl]-S-phenylglycine t-butyl ester,DAPT)、二甲基亚砜(DMSO)、RIPA裂解液和TBST购于美国Sigma公司。大鼠抗巢蛋白(Nestin)抗体购于美国Chemicon公司,小鼠抗微管蛋白3β(Tuj-1)抗体购于美国BioLegend公司,兔抗胶质纤维酸性蛋白(GFAP)抗体购于美国DAKO公司,兔抗GalC抗体、TRIZol购于美国Invitrogen公司,兔抗转录激活因子5(ATF5)单抗、小鼠抗Notch1单抗,荧光二抗Alexa Fluor 488山羊抗大鼠IgG、Alexa Fluor 488山羊抗小鼠IgG、Alexa Fluor 555山羊抗小鼠IgG、Alexa Fluor 555山羊抗兔IgG,DAPI,WB一抗β-actin、WB二抗HRP偶联山羊抗小鼠IgG和山羊抗兔IgG均购于美国Abcam公司。SDS-PAGE和PVDF膜购于美国BioRad Laboratories公司。

1.2 spNSPCs的分离培养

为了研究成年大鼠脊髓干祖细胞(spNSPCs),参照Hugnot[4]提出的培养方案,建立了spNSPCs原代分离培养体系。6-8周龄C56BL/6小鼠处死后无菌条件下剥离硬脊膜,分离T1至T12脊髓,将脊髓研碎后加入0.25%胰酶中,于37 ℃孵箱中消化30 min,加5%胎牛血清终止消化,漂洗后用火焰抛光的巴斯德吸管反复吹打成单细胞悬液,用70 μm滤网过滤并离心冲洗,台盼蓝计数,按105/ml密度植于spNSPCs培养基(DMEM/F12+2%B27+1%N2+20 ng/ml EGF+20 ng/ml bFGF)中,每3.5 d半量换液。每5-7 d进行传代,3-7代用于以下实验。

1.3 spNSPCs的分化实验

为了对spNSPCs的神经及胶质细胞分化能力进行鉴定并进行下一步实验,将spNSPCs贴壁培养在经过包被的细胞培养盖玻片上,分别采用神经元、星形胶质细胞和少突胶质细胞的分化培养基对其进行定向分化。采用免疫细胞荧光染色,分别以神经元标志物Tuj1、星形胶质细胞标志物GFAP和少突胶质细胞标志物GalC对其分化潜能进行鉴定。spNSPCs传代后,将其培养于Poly-L-Lysine和Laminin包被过的细胞培养盖玻片上,分别采用神经元分化培养基(Neurobasal Medium+2% B27+2 mmol/L GlutaMAX-I Supplement),星形胶质细胞分化培养基(DMEM+1% N-2 Supplement+2 mmol/L GlutaMAX-I Supplement+1% FBS)和少突胶质细胞分化培养基(Neurobasal Medium+2%B27+2 mmol/L GlutaMAX-I Supplement+30 ng/ml T3)对其进行定向分化。

1.4 实验分组

DAPT是γ-分泌酶抑制剂,抑制γ-分泌酶底物Notch的三级酶切从而减少Notch受体胞内段的释放,进而影响Notch信号通路调控的细胞信号传导和分化进程。本实验将分化培养的spNSPCs分为两组,实验组加入10 μmol/L DAPT,对照组加入相应的0.02%(V/V,体积分数)DMSO。实验组和对照组分别进行以下实验。

1.5 免疫荧光细胞染色

鉴于转录激活因子5(ATF5)在神经系统中的广泛作用,选择了Notch信号通路中最早被发现也是最主要的成员Notch1来观察Notch信号与ATF5的表达情况。载有spNSPCs的细胞培养盖玻片经4% PFA固定,PBS冲洗,并在室温下含有0.3% Triton X-100及1% BSA的PBS溶液进行1 h的穿孔和封闭后,加入稀释一抗溶液在4 ℃下孵育过夜(Nestin 1 ∶100;Tuj1 1 ∶200;GFAP 1 ∶500;GalC 1 ∶50;ATF5 1 ∶500)。次晨吸弃一抗溶液,PBS冲洗3次,每次5 min。加入对应的稀释二抗溶液(1 ∶500)及DAPI(1 ∶1 000)室温下孵育1 h,PBS冲洗封片,光镜观察。图像采集由奥林巴斯荧光显微镜(AxioVert. A1)或奥林巴斯激光共聚焦显微镜(FV 1000)完成。

1.6 免疫印迹法检测蛋白表达水平

免疫印迹(Western blot)采用标准实验流程,提取分化10 d的spNSPCs,加入含有蛋白酶抑制剂的RIPA裂解液,BCA法测定蛋白浓度。20 μg蛋白样品上样,SDS-PAGE凝胶电泳分离蛋白,半干法将蛋白质转移至PVDF膜上。将转好的PVDF膜于室温下在摇床上用5%脱脂牛奶TBST溶液封闭1 h。分别加入一抗稀释液(Notch1 1 ∶1 000;ATF5 1 ∶2 000;β-actin 1 ∶4 000)4 ℃孵育过夜。用TBST溶液洗膜3次,每次10 min。加入二抗稀释液室温下孵育1 h。洗膜后在增强化学发光反应混合液中反应并拍片显影,图像灰度数据分析采用Image J软件。

1.7 实时定量PCR检测ATF5的mRNA表达水平

TRIzol法提取不同组别spNSPCs总RNA,定量后按照说明书使用Takara反转录试剂盒获得cDNA。参照Genbank中ATF5和内参β-actin基因序列设计引物:ATF5上游引物为5′-AAGTCGGCGGCTCTGAGGTA-3′,下游引物为3′-GGACTCTGCCCGTTCCTTCA-5′;β-actin上游引物为5′-GTGGGCCGCTCTAGGCACCA A-3′,下游引物为3′-CTCTTTGATGTCACGCACGAT-5′。以cDNA(6 μl)为模板,加入上、下游引物(10 μmol/L,各2.0 μl)和SYBR Green(10 μl)构建为PCR反应体系,在94 ℃ 50 s,55 ℃ 50 s,72 ℃ 50 s,72 ℃ 10 min反应条件下连续进行40个循环。2-ΔΔCt定量分析ATF5的mRNA表达情况。

1.8 统计学分析

使用SPSS17.0软件对上述测量进行统计,以平均数±标准差的形式表示,组间对比采用学生双尾t检验,P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 spNSPCs分离培养与鉴定结果

悬浮培养条件下,spNSPCs在传代后3 d开始形成神经球,对其进行神经干细胞标志物Nestin的免疫荧光染色结果显示阳性(见图1)。

spNSPCs具有向神经元、星形胶质细胞和少突胶质细胞分化的能力(见图2)。

图1 脊髓来源神经干祖细胞(spNSPCs)悬浮培养形成神经球Nestin的表达情况Figure 1 Nestin expression of neurosphere formed by spinal cord derived neural stem and progenitor cells

图2 spNSPCs具备向神经元、星形胶质细胞和少突胶质细胞分化的能力Figure 2 Capability of spNSPCs to differentiate into neurons, astrocytes and oligodendrocytes

2.2 DAPT对spNSPCs分化能力的调控作用

通过与对照组对比,DAPT组神经元标志物Tuj1的阳性比例从8.6%上升到23.3%(P<0.05,见图3A和B),而星形胶质细胞标志物GFAP的阳性比例从65.7%下降到42.1%(P<0.05,见图3C和D)。结果表明,DAPT能够促进spNSPCs向神经元方向分化,抑制其向星形胶质细胞方向分化。

2.3 Notch信号通路通过ATF5调控spNSPCs的分化

首先通过免疫细胞染色发现ATF5与Notch1胞内段共表达(见图4A),这个结果进一步提示ATF5可能在Notch信号转导中发挥作用。继而通过免疫印迹和实时定量PCR法检测了ATF5在对照组和DAPT组中的表达情况(见图4B和C),发现使用DAPT后Notch1胞内段的表达较对照组下降了26%(P<0.05),随着Notch1活性的下降,ATF5的蛋白水平上升了60%(P<0.05),mRNA水平上升了108%(P<0.05)。

3 讨论

如何促进脊髓损伤后内外源性修复作用,促进脊髓损伤的康复及功能改善,是骨科尤其是脊柱外科医师面临的重要问题,具有重大的社会和经济效益。脊髓神经干祖细胞(spNSPCs)既具有一般神经干细胞的特性,又具有脊髓同源性的特征,使其成为神经干细胞移植治疗脊髓损伤最有前途的候选者[5]。我们成功分离培养了spNSPCs,并且通过体外定向分化诱导验证了spNSPCs向神经和胶质细胞分化的潜能。但是,如何促进脊髓内源性及外源性的神经干细胞向神经元分化、减少星形胶质细胞的产生、促进轴突再生,是治疗脊髓损伤的热点问题,为治疗脊髓损伤提供了理论依据和新思路。

Notch家族由高度保守的蛋白质组成,在许多物种的细胞中均有表达,对细胞的发生发育、增殖分化以及凋亡过程具有重要的调控作用。当Notch受体与配体结合后,激活金属蛋白酶家族的肿瘤坏死因子α转换酶在S2位点切去Notch受体大部分的胞外区,再诱导γ-分泌酶在S3位点切割Notch受体,释放受体胞内段,胞内段经核定位到细胞核内,刺激靶基因E家族从而调节神经系统的发生[6]。DAPT就是通过抑制γ-分泌酶来发挥抑制Notch信号通路的作用的。长期以来,Notch信号通路是通过“旁侧抑制”来调控细胞分化的。神经前体细胞随时间、空间和部位的不同对Notch信号的反应不同。一般认为,下调Notch信号通路会抑制神经干细胞的增殖[7],促进其分化。Chapouton等[8]在斑马鱼体内研究指出,Notch信号通路的活性控制着静止期和活动期神经干细胞的平衡。Notch信号激活可以使神经前体细胞进入G0期,使用Notch信号通路抑制剂DAPT可以使其重新进入G1期并且向神经元分化。Borghese等[9]发现,抑制Notch信号通路,可以延缓人胚胎干细胞来源的神经干细胞由G1期向S期转化,并且可以加速其向神经细胞分化。本研究中,为了观察Notch信号对spNSPCs分化能力的调控作用,使用γ-分泌酶抑制剂DAPT抑制Notch受体的水解酶切,减少Notch受体胞内段的释放,从而达到抑制Notch信号通路的作用。首次证实了对于体外培养的脊髓来源的神经干祖细胞,使用Notch信号通路抑制剂后,神经元分化增多,星形胶质细胞分化减少。所有这些发现都指示着,脊髓损伤后Notch信号通路激活,Notch1在室管膜区高表达,Notch信号表达增强可能是成年脊髓损伤后再生能力有限的重要原因,抑制Notch信号通路活性,可以促进脊髓损伤后功能重建。以上都表明,在中枢神经系统发育的过程中,Notch信号的作用主要表现为促进神经干细胞的增殖、抑制其分化,抑制神经干细胞向神经元和少突胶质细胞分化,而促进向星形胶质细胞分化。

与对照组比较，* P<0.05图3 DAPT对spNSPCs分化能力的调控作用Figure 3 Regulation effects of DAPT on the differentiation of spNSPCs

与对照组比较，* P<0.05图4 spNSPCs中Notch1与ATF5的共表达情况及相互关系Figure 4 The coexpression and interaction between Notch1 and ATF5 in spNSPCs

Notch信号如何调控神经干细胞分化一直是神经科学研究的重点和热点。转录激活因子5(ATF5)能够通过与细胞内多种蛋白分子相互作用形成复合物,从而共同调控细胞的生命过程。ATF5在诸如乳腺癌、黑色素瘤、脑肿瘤等多种肿瘤的增殖和凋亡中发挥调控作用[10]。而ATF5在神经系统的发生发育中也发挥着广泛和重要的作用,例如嗅神经元的终末分化和存活[11]等。尤其在神经干细胞分化上,既往研究表明异丙酚抑制的神经干细胞向神经元分化是通过下调ATF5发挥作用的[12],ATF5下调是神经前体细胞向星形胶质细胞分化的必不可少的关键调节因子[13]。本实验的结果与上述结果相佐证,并首次证明了ATF5在Notch信号通路调控的spNSPCs分化中发挥着极为重要的作用,表明,ATF5上调会促进神经干细胞向神经元分化,抑制其向星形胶质细胞分化。下一步拟构建ATF5显性负性失活的spNSPCs来深入分析ATF5是如何在Notch调控spNSPCs分化中发挥作用的。

综上所述,DAPT可以有效抑制spNSPCs中Notch信号活性,DAPT抑制Notch活性可以促进spNSPCs向神经元分化并抑制其向星形胶质细胞分化,ATF5在这种分化作用中发挥着重要作用。