超声造影定量分析评价脓毒血症兔致急性肾损伤肾功能状态的研究

孙己晶 ，张兆光 ，陈学勋 ，王翠花 ，马桂凤 ，赵荣荣 ，罗倩 ，郭民

1.潍坊医学院，山东潍坊 261000；2.潍坊医学院附属医院，山东潍坊 261041

脓毒血症是感染引起的全身炎症反应综合征，严重者可引起脓毒症休克，甚至多器官功能衰竭。急性肾衰竭是危重症患者常见的并发症，其病死率高于其他原因引起的急性肾衰竭。因此，早期识别急性肾损伤，尽早干预可明显降低其死亡率。该文旨在探讨超声造影技术在急性肾损伤早期肾功能评价中的应用价值。

1 材料与方法

1.1 仪器

iU22彩色多普勒超声显像仪，超声造影剂Sono Vue,自动生化分析仪，ELISA试剂盒。

1.2 动物模型制备

健康新西兰白兔20只，雄、雌各10只，体重1.5～2.5 kg，适应性喂养1周，实验前禁食12 h，手术组采用CLP复制脓毒血症AKI模型，即用10%水合氯醛0.3 mL/100 g腹腔麻醉，无菌条件下沿腹中线切开长约2 cm，分离、结扎盲肠，在盲端肠壁用12号针穿刺2次，留置1条长1 cm宽2 mm、两头贯穿盲肠的橡皮片，挤出少许粪便，将盲肠还纳，逐层缝合腹壁，编号，清醒后转入代谢笼内自由进水、进食。术毕补充生理盐水3 mL/100 g，术后自由饮水，并给予抗生素及相应支持治疗。28只存活超过12 h。

1.3 留取标本

从术后腹壁缝合结束开始计时，分别于0、2、4、6、12 h为观察点，下腔静脉抽血5 mL，离心（3 000 r/min）15 min，取血清于-20℃保存，采用生化分析仪待测Scr、BUN；膀胱分离，膀胱穿刺收集尿标本于-20℃保存，采用 ELISA 法待测 KIM-1、IL-8、NGAL；后随机处死一只兔子，取左肾切开置于10%多聚甲醛中固定，石蜡包埋，HE染色，光镜下×200下取3个视野观察肾脏病理变化。

1.4 超声造影检查方式

经兔耳缘静脉注入超声造影剂混悬液，每次剂量为0.2 mL，随后注入2 mL生理盐水。同时启动图像采集，观察140S内肾实质回声变化,用随机定量分析软件对感兴趣区域进行动态分析研究，检查结束后，在机曲线拟和,获得肾灌注时间-密度曲线及一系列灌注参数，使用DICOM格式记录各个时间点的数据。

1.5 统计方法

使用SPSS 17.0统计学软件进行数据分析，计量资料以均数±标准差（±s）表示，行t检验，对所有连续变量进行分布正态性检验，组间比较SNK-q检验，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 兔肾功能的变化

CLP 术后 6 h，脓毒血症兔尿 KIM-L、NGAL、IL-18均于6 h开始显著升高，12 h更高，均显著高于建模前（P＜0.05）。 建模后 12 h，脓毒血症兔 Scr、Urea 的浓度显著升高，均明显著高于建模前（P＜0.05）。

2.2 兔肾脏病理改变

HE染色光镜下，建模前肾小球、肾小管结构正常；模型组6 h开始出现炎性损伤，以12 h为著，表现为弥漫性单核-巨核细胞浸润，组织间隙水肿，肾小管上皮细胞空泡变性、肿胀、脱落，甚至出现裸膜，部分肾小管腔闭塞，肾小管腔代偿扩张，管型形成。

表1 建模前及建模后不同时间点肾功能指标的变化情况（±s）

表1 建模前及建模后不同时间点肾功能指标的变化情况（±s）

注:与建模前同侧肾脏比较，aP<0.05。

指标0 h 2 h 4 h 6 h 12 h Scr（μmol/L）Urea（mmol/L）KIM-1（ng/L）NGAL（μg/mL）IL-18（pg/mL）50.2±7.8 3.35±1.72 1.19±0.14 0.56±0.11 58.32±18.53 65.31±10.82 5.22±3.01 1.21±0.07 0.73±0.39 62.64±20.41 70.42±13.25 8.25±4.01 1.41±0.16 1.10±0.76 70.46±21.45 72.38±10.8 9.02±5.01（2.54±0.77）a（2.40±0.99）a（96.95±23.47）a（102.18±14.91）a（13.54±3.11）a（3.92±0.23）a（3.19±0.87）a（117.61±38.0）a

表2 建模前后各时间点肾皮质各项灌注参数比较（±s）

表2 建模前后各时间点肾皮质各项灌注参数比较（±s）

注：与建模前同侧肾脏比较，aP<0.05，bP<0.01。

指标 部位0 h 2 h 4 h AUC（dB·s）TTP（t/s）DPI（dB）A（dB·s）α（dB·s）左肾右肾左肾右肾左肾右肾左肾右肾左肾右肾135.6±68.4 129.5±64.8 6.3±3.7 6.2±3.5 6.1±3.5 5.9±3.8 3.2±1.5 3.1±1.8 0.19±0.15 0.17±0.14 169.2±78.4 172.6±76.7 8.3±5.6 8.5±4.9 5.9±4.2 5.8±4.0 3.0±1.5 2.9±1.3 0.14±0.18 0.15±0.15（279.2±55.5）a（277.6±58.4）a（10.5±4.9）a（11.1±6.3）a 5.5±3.2 5.6±3.5（2.2±1.5）a（2.4±1.6）a（0.09±0.03）a（0.09±0.02）a 6 h 12 h（289.2±62.3）a（269.7±68.5）a（13.5±5.7）a（13.8±5.3）a（4.3±3.0）a（4.1±3.3）a（2.0±1.4）a（2.1±1.7）a（0.06±0.04）a（0.07±0.05）a（309.2±78.8）b（310.7±80.4）b（16.7±7.6）b（15.9±7.1）b（4.0±3.2）a（4.0±3.5）a（1.8±0.8）b（1.9±0.7）b（0.04±0.02）b（0.04±0.02）b

2.3 肾皮质灌注实时观察及参数分析

团注超声造影剂后，观察到肾脏由肾动脉、肾皮质、肾髓质的顺序依次明显增强，随后逐渐消退。建模后4 h左右肾的肾皮质AUC较建模前显著增大 （P<0.05），TTP 较建模前显著延长 （P<0.05），α、A 均显著低于建模前（P<0.05），6、12 h 更著（P＜0.01），DPI于建模后6、12 h显著低于建模前（P<0.05），而两肾各时间点比较差异无统计学意义（P＞0.05）。

3 讨论

脓毒血症时，肾脏内皮细胞不仅被激活，产生炎症因子，同时也是炎症因子首要攻击的靶细胞之一，从而导致肾脏灌注减少，造成肾脏损伤[1-2]。因此，及早发现并防治脓毒血症并发急性肾损伤，保护肾功能意义重大。

目前对于AKI的功能检测，通常采用Scr、BUN来评价[3]，但临床上，GFR下降到正常的1/3时，Scr开始上升；GFR下降到正常的50%以下时，BUN开始上升[4]。一旦疾病诊断成立时，肾功能往往已到了不可挽回的地步，而且Scr、BUN受年龄、性别、药物、肌肉代谢及操作方法等多因素影响，因此，并不是AKI早期评价肾功能最理想的方法。肾脏组织活检是确定肾脏病理改变的唯一方法，但其属有创性检查，具有一定的风险，且患者依从性较差。通过复习相关文献，筛选出可能在脓毒血症致AKI早期发生特异性改变的尿液的生物学标记物，如 NGAL、KIM-1、IL-8，测定这些生物学标记物在脓毒血症发生后的水平，可早期发现肾功能的损害，与传统意义的血肌酐、尿素氮相比，是更早期的敏感指标，但这些标记物同样受限于尿标本的采集和检验的局限性。该实验发现：CLP术后，脓毒血症兔尿KIM-L、NGAL、IL-18均于6 h开始显著升高，12 h更高，均显著高于建模前，差异有统计学意义（P<0.05）。 建模后 12 h，脓毒血症兔 Scr、Urea 的浓度显著升高，均明显著高于建模前，差异有统计学意义（P<0.05）。 表 1 可见，KIM-L、NGAL、IL-18 是较 Scr、Urea更能早期反映肾功能状态的指标。

超声造影作为一种全新血流成像模式，更敏感、精确地显示急性肾损伤早期肾脏血流灌注状态的改变，尤其是对微小血管可提供更敏感、真实的血流信息，为临床早期诊断急性肾损伤提供了新途径[5]。肾皮质灌注的实时观察及灌注参数分析：经肘静脉团注超声造影剂后，可以观察到沿肾动脉、肾皮质、肾髓质显影依次明显增强，随后逐渐消退。随着肾脏病情不断进展，各超声造影灌注参数值在不同时期均发生显著变化。Dong等[6]、Wang等[7]的研究同样表明超声造影技术通过TIC曲线各灌注参数的变化来监测患者肾功能状态的改变。如表2所示：建模后4 h左右肾的肾皮质曲线下面积 （279.2±55.5）dB·s 较建模前（135.6±68.4）dB·s 显著增大 （P<0.05）， 达峰时间（10.5±4.9）t/s 较建模前 （6.3±3.7）t/s 显著延长 （P<0.05），另外，下降斜率（α）、上升斜率（A）均显著低于建模前（P<0.05），6、12 h 更为显著（P<0.01），达峰绝对值（DPI）于建模后 6 h、12 h 显著低于建模前（P<0.05），而两肾各时间点比较差异无统计学意义 （P＞0.05）。通过对肾皮质血流灌注的实时动态监测，超声造影技术能够准确显示脓毒血症兔急性肾损伤早期血流动力学变化，于4 h后就发生显著改变。该实验结果表明，在兔AKI早期，超声造影灌注参数值较血肌酐、尿素氮更敏感、精确，与毛世杰[8]等研究结果一致，且早于较敏感的尿KIM-L、NGAL、IL-18，而且随着肾功能的下降，测定参数也随之变化。

该研究建立比较完善的脓毒血症肾功能损害的动物模型，应用超声造影定量分析技术对动物肾脏的血流灌注、肾功能状态进行分析，为临床早期判断脓毒血症肾功能状况提供一种新的手段。同时，可以作为AKI保守治疗有效的监测工具和手段[9]。